Transcript Document
Mag net EI+ 7.22
e4
Hmotnostní spektrometrie (1)
12_ Chu dob a_HC VDG rigs 57 by_ 1ACC 12 (0 .677
) 100 71 % 43 28 41 29 55 32 67 83 85 81 79 97 95 93 99 111 105 113 125 120 127 137 153 155 160 165 140 67 100 80 27 69 54 60 0 20 40 183 180 197 200 211 225 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z
Josef Chudoba
OBSAH
Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků způsoby měření spekter Rozlišovací schopnost spektrometru Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii Typy hmotnostních spektrometrů Součásti hmotnostního spektrometru – iontový zdroj separátor iontů vakuový systém způsob dávkování vzorku
Hmotnostn í spektrometrie (Mass Spectrometry – MS)
Analytická technika pro analýzu organických sloučenin Kvalitativní analýza – identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny) Kvantitativní analýza – sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích Ale i sledov ání obsahu kovů (ICP MS) Speciální aplikace pak např. ISOTOPE RATIO MS Podstatou MS je detekce vzorku při IONIZACI – jedná se o destruktivní metodu – vzorek je při analýze znehodnocen
nabitých částic
(iontů), které vznikají z molekul
VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT ?
VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT
V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin Od vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru
CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA
1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny) 2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br) 3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny 4) Je li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny
Hmotnostní spektrum
Intenzita
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100
[ M + H ] +
734.4691
Molekulový resp. pseudomolekulový ion
Magnet EI+ 6.35e12
Izotopické příspěvky
735.4691
0 731 732 733 734 735 736 736.4769
737 738 739 mass m/z
Osa x:
m/z – hmotnost iontu dělena jeho nábojem
Osa y:
intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor – je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru – nejvyšší pík má výšku 100 %
Hmotnostní spektrum
Režim záznamu dat
centrovaný (centroid) – především u GC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar „čáry“ kontinuální (continous) – u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku O
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100
[ M + H ]
734.4691
+
735.4691
736.4769
H 3 C H 3 C OH OH O H 3 C CH 3 O CH 3 O CH 3 OH CH 3 H O O O O H 3 C N CH 3 H 3 C O CH 3 CH 3 CH 3 Magnet EI+ 6.35e12
Erythromycin
OH 0 07_Blazek_PO5_1 (15.245) Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100 734.4691
Magnet EI+ 6.35e12
0 731 732 733 734 735 735.4725
736 736.4753
737 737.4780
738 739 mass
MOLEKULOVÁ HMOTNOST
Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da) 1 Da = 1 amu (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12 C 1 Da = 1,660 338 782 x 10 -27 kg Molekulová hmotnost – hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka amu) Molární hmotnost – hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol) číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné
monoisotopická
v praxi počítána z hmotností nejstabilnějších (nejvíce zastoupených izotopů prvků),
průměrná
zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků
nominální
– zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost
MOLEKULOVÁ HMOTNOST
bromobenzene Br
V MS spektrech vždy MONOISOTOPICKÁ hmotnost
100 Nominal Mass = 156 Da Monoisotopic Mass = 155.957455 Da Average Mass = 157.0079 Da Molecular Formula = C 6 H 5 Br benzene 50 51 12 27 38 0 10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo 60 70 77 Br 156 90 104113 110 128 130 143 150 170 78 100 Nominal Mass = 78 Da Monoisotopic Mass = 78.04695 Da Average Mass = 78.1118 Da Molecular Formula = C 6 H 6 50 15 0 10 20 (mainlib) Benzene 26 30 39 40 51 50 60 63 70 74 80 90
Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru
1) Jaká ionizační technika byla při měření použita
tvrdé ionizační techniky – vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí měkké ionizační techniky – malá nebo skoro žádná fragmentace
2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno
hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) – v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů hmota s přesností na desetinná místa
3) Jaký experiment
(MS vs MS/MS nebo IN SOURCE fragmentace MS)
Rozlišovací schopnost spektrometru (R) – jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností
R = m/
D
m m … m/z iontu,
D
m . . . rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů
Různé definice rozlišení: „valley“ definice vycházející s překryvu píků „FWHM“ (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku
Převzato z materiálu Fischer Scientific
VYSOKÉ rozlišení (HIGH RESOLUTION)
Jsou li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou
[ M + H ] +
Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná?
Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů – chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace
Chyba při měření hmoty (
D
m acc )
D
m acc (ppm) = 10 6 x
D
m acc / m TRUE
D
m acc = m MEASURED m TRUE
Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku
Hmotn ostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité IONIZAČNÍ TECHNICE
IONIZACE –
tvrdá
(vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů) Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 70 eV /
EI + 70 eV
/ rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek – databáze spekter (NIST, WILLEY) V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů) IONIZACE –
měkká
(dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly) Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách Elektrosprejová ionazace /
ESI
/. chemická ionizace za atmosferického tlaku /
APCI
/ kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů)
MALDI
(Matrix Assisted Laser Desorption) – pro vysokomolekulární sloučeniny
Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum
GC/MS analýza efedrinu
Informace
z MS spektra – zastoupení izotopů prvků
Prvek
Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě
Izotop % rel.
Izotop % rel.
Izotop % rel.
Uhlík Vodík Dusík Kyslík Síra Chlor Brom 12 C 1 H 14 N 16 O 32 S 35 Cl 79 Br 100 100 100 100 100 100 100 13 C 2 H 15 N 17 O 33 S 1,11 0,016 0,38 0,04 0,78 18 O 34 S 37 Cl 81 Br
A prvky
A+2 prvky A+1 prvky F, I, P, H(vzhledem k nízké intenzitě A+1) 0,20 4,40 32,5 98,0
1 ul, split 1:20 1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br2 100 160 5.00e12
Br 2 07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br 100 78.9183
80.9163
5.07e12
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (12.550) Is (1.00,1.00) Cl2 100 70 5.74e12
72 Cl 2
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl 100 34.9689
7.58e12
158 162
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br3 100 239 241 3.80e12
0 150 160 170 mass 237 243 Br 3 36.9659
74 0 66 68 70 72 74 76 78 80 mass
1 ul, split 1:20
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl3 100 105 4.35e12
107 Cl 3 0 70 75 80 85 90 mass
Br I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1
0 230 235 240 245 250 mass 0 25 30 35 40 45 mass
Cl I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1
109 0 100 111 110 120 mass
100 50 25 32 38 43 51 56 61 0 20 30 40 50 (mainlib) Benzene, chloro 60 77 100 Cl 112
m/z 77 45,3 % m/z 112 100 % m/z 113 6,9 %
77 70 74 80 84 90 97 100 110 120 130
m/z 114 32,9 %
50 51 12 27 38 0 10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo 60 70 Br 156 90 104113 110 128 130 143 150 170
m/z 77 100 % m/z 156 61,8 % m/z 157 4,1 % m/z 158 59,8 %
77 100 204 I 50 51 27 37 60 0 20 40 60 (mainlib) Benzene, iodo 80 100 127 120 140 152 160 176 180 200 220
m/z 77 100 % m/z 204 74,5 % m/z 205 4,4 %
100
A:m/z 78 100 % A+1:m/z 79 6,5 %
78 Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn)
Cn
50 15 0 10 (mainlib) Benzene 20 26 30 100 39 40 40
A:m/z 154 100 % A+1:m/z 155 12,9 %
50 51 49 53 50 60 63 70 74 80 90 154 27 0 20 30 (mainlib) Biphenyl 39 40 51 50 60 63 70 76 80 89 90 102 100 110 115 120 128 130 139 140 150 160 170
I
(
I
(
A
1 ) * 1 , 1 * 100
A
)
Molekulový ion v hmotnostním spektru
Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché
EI+ 70 eV
u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra)
ESI
– tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů
APCI
– možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji) Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní
EI+ 70 eV:
Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zak čas) ázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost – vyšší bod varu – delší retenční
ESI
: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů
Chemická pravidla: Dusíkové pravidlo
Dusík – m= 14 Da, třívazný prvek žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo lichý počet atomů dusíku v molekule -> molekulov á hmotnost látky je LICHÉ číslo EI+70 eV
:
0 nebo sudý počet
N: m/z molekulového iontu
sud é
m/z fragmentů
liché
číslo číslo
lichý
počet N: m/z molekulového iontu
liché
m/z fragmentů
sudé
číslo číslo
ESI+: 0 nebo sudý počet
N: m/z [M+H] + iontu
liché
číslo
lichý počet
N: m/z [M+H]+ iontu
sudé
číslo
ESI-:
0 nebo
sudý počet
N: m/z [M-H] iontu
liché
číslo
lichý počet
N: m/z [M-H]- iontu
sudé
číslo
Chemická pravidla: Počet kruhů a dvojných vazeb – Rings + Double Bonds (R + DB)
Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly
R+DB = C – ½ H + ½ N +1
C = počet čtyřvazných atomů – C, Si H = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F … (halogeny) N = trojvazných atomů N, P, As Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, O), ale třeba DMSO – síra je čtyřvazná 1 kruh Příklad: fenol C 6 H 5 OH
R+DB = 6 –1/2*6+1/2*0+1 = 4 Aromáty : R+DB = minimálně 4
3 dvojné vazby
Využití R+DB a
dusíkového
pravidla EI+ 70 eV: Celočíselná hodnota R+DB
může být molekulový ion ion s lichým počtem elektronů Neceločíselná hodnota R+DB
nemůže být molekulový ion ion se sudým počtem elektronů
Využití při strukturní analýze
Elementární analýza z High Res MS spektra
V ždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum – org. látky C, H, N, O, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení)
ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA
O H 3 C H 3 C OH OH O H 3 C CH 3 O CH 3 O CH 3 OH CH 3 H O O O O
Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry
H 3 C N CH 3 CH 3
Erythromycin C Mw monoiso C max = 52, H max 37 H 67 NO 13 = 734,4691 Da Příklad vstupní parametry: = 106, N max = 15, O max = 15
1 – 3
ppm
H 3 C O CH 3 CH 3 Výsledek: navržené kombinace C x H y (N z ,O z ,S z …) OH
Přesnost měření - chyba hmoty (ppm
) 10 5 2 1
38 výsledků 17 výsledků 9 výsledků 4 výsledky
Aplikace „chemických“ pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací !! – řešeno softwarově
Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny?
GC/MS
Elektronová ionizace (EI+ 70 eV)
v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-CO- (teplotně labilní)
Chemická ionizace (CI)
v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) – většinou pouze na vybrané typy sloučenin LC/MS
Elektrosprejová ionizace (ESI)
sloučeniny – pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové
Atmosferická chemická ionizace (APCI)
pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze) ale při vyšší teplotě než ESI, sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu
MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI)
pevné matrice vzorku laserem – vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny) – ionizace vzorku v přítomnosti
Existuje celá řada dalších ionizačních technik – cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována.
Jak velké molekuly lze analyzovat
Zdroj: Agilent Technologies
Jak velké molekuly lze analyzovat GC/MS LC/MS
Kvadrupol (Q) Iontová past (IT) V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1000 – 2000, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)
GC/MS LC/MS
TOF (Time of Flight)
LC/MS
ORBITRAP Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 40000), maximální m/z a ž 500 kDa, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter) měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~100000), maximální m/z ~ 4 kDa, pomalejší frekvence sběru dat (spekter)
GC/MS
Magnetický sektor měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~40000), maximální m/z ~ 2000, pomalejší frekvence sběru dat (spekter),
Přístroje hybridní – umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů) GC/MS LC/MS
Tripple Quad (QQQ) Trojitý quadrupol
LC/MS
Q-TOF
LC/MS
Ion Trap – ORBITRAP Quadrupol – Time Of Flight iontová past - Orbitrap nebo IT-TOF
Jak velké molekuly lze analyzovat ?
MALDI 100 - 1000 kDa ESI až 100 kDa TOF ORBITRAP APCI až 2 kDa EI+ 70 eV / CI až 1 - 2 kDa ION TRAP QUADRUPOLE
Schéma hmotnostního spektrometru Inlet
Plynový chromatograf Kapalinový chromatgraf Direct Insertion (Infussion) Probe MALDI destička
Iontový zdroj
Ionizační techniky: EI+, CI, APCI, ESI, MALDI
Analyzátor
Iontový separátor Detektor vakuum
Režimy snímání dat: MS experiment
SIM (SIR)
Intenzita
TIC
m/z čas
Full SCAN (Total Ion Current TIC)
cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z Rekonstruovaný chromatogram (RIC) ion a vykreslí se
z TICu se vybere požadovaný chromatografický záznam Selected Ion Monitoring (SIM)
cyklicky se snímají jen vybrané ionty
citlivější než TIC režim
např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí:
TIC řádově ng (10 –9 g)
SIM řádově pg (10 (10 -15 g) –12 g) až fg
Re žimy snímání dat: MS/MS experimenty
Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad Detektor Iontový zdroj Kolizní cela
Product Ion Scan:
Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce
Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS 2 ); Ion Trap (až MS 10 ) s vyšším MS n klesá citlivost!
Precursor Ion Scan:
Q1:TIC (m/z 1 – m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce
Instrumentace: nelze na Ion Trap
Constant Neutral Loss Scan:
Q3: TIC ((m/z 1 D N) – (m/z 2 D N)) detekce; odpadající neutrální částice z iontu Q1:TIC (m/z 1 – m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu D N – rozdíl hmotností iontů – hmotnost Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap
Selective Reacrion Monitoring (SRM):
iontu Q3: SIM detekce Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)
Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité …
Cena, provozní náklady, účel využití !!!
Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS
Technické parametry:
Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů) Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z) Rychlost scanování (počet scanů/s) Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu) Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení) Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje) Vakuum (je li třeba vyšší stupeň vakua – vyšší cena)
Požadavky na instalaci:
Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné) Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TOP) x velké (hmotnost > 500 kg) Plyny – např. LC-MS průtok N 2 kapalného N 2 až 500 l/min – nutný generátor N 2 nebo zdroj
MS - iontový zdroj a ionizační technika
Electron Impact (EI + 70 eV) – elektronová ionizace nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu moleku lového iontu pohybuje okolo 10 eV
70 eV přebytek energie dostatečný pro tvorbu moleku lového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter EI+ dnes běžně ve spojení s GC Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze Ionizace probíhá ve vakuu Schéma EI+ ionizačního zdroje
MS - iontový zdroj a ionizační technika
ESI (Electrospray)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na) + ionizace probíhá za atmosferického tlaku
MS - iontový zdroj a ionizační technika
APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty zmlžovacího plynu (N 2 ) , mobilní fáze a analytu. Ionty plynu reagují s molekulami mobilní fáze a vzniklé ionty předají náboj analytu.
MS - iontový zdroj a ionizační technika
Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI.
U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu – nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód
APCI – první komerční využití – 1986 oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace ESI – první komerční využití – 1988 2002 – Nobelova cena za chemii: John Bennett Fenn Kompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli
MS - iontový zdroj a ionizační technika
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption)
Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě „pevné směsi“ matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TOF analyzátorem. Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek m M roztok, matrice 100 mM roztok Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H) + , (M+K) + , (M+Na) + NELZE spojit s HPLC!!!
Spotovac í destička
Zdroj:Agilent Technologies
Zdroj:Agilent Technologies
MS - separátory iontů
lineární kvadrupol
konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat. Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadru polem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z
MS - separátory iontů
Iontová past (ion trap)
účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou.
Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách
s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru
MS - separátory iontů
Průletový analyzátor (time of flight TOF)
K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru.
je tvořen prázdnou trubicí.
Nutná konstatantní stabilní teplota - st
Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později.
Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí.
MS - separátory iontů
Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole
umožňuje prostorové
B
m
/
z
B
.
r
2 2 .
V
r
V ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech
dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti
ORBITRAP
MS - separátory iontů
Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do Orbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat – generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum
elektroda Octapole Osa z
z
~
konst
.
m
/
z
MS - detektor iontů
detektor
separátorem zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony a ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení.
Fotonásobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.
MS - vakuum
EI+ 70 eV, CI, MALDI – vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány) Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua 1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy – vakuum cca 10 -2 mBar – slouží pro provoz pump 2. stupně vakua
MS - vakuum
2. Stupeň vakua cca 10 -5 až 10 -8 mBar (1 mBar = cca 100 Pa) turbomolekulární pumpa difuzní olejová pumpa
MS - způsob vnosu vzorku
EI+ 70 eV: GC/MS – kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet) evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) – vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lock ESI, APCI: LC/MS – mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje) Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje
Hmotnostní spektrometr
Přenosný GC-MS HAPSITE (firma Inficon, Inc. U.S.A)
Nasazení v Afganistánu (britské jednotky)
Hmotnostní spektrometr
Sektorový hmotnostní spektrometr
Hmotnostní spektrometr
Kvadrupolový hmotnostní spektrometr s GC chromatografem
Hmotnostní spektrometr
IT ORBITRAP hybridní MS spektrometr