Document

Transcript Document

Mag net EI+ 7.22

Hmotnostní spektrometrie (1)

12_ Chu dob a_HC VDG rigs 57 by_ 1ACC 12 (0 .677

) 100 71 % 43 28 41 29 55 32 67 83 85 81 79 97 95 93 99 111 105 113 125 120 127 137 153 155 160 165 140 67 100 80 27 69 54 60 0 20 40 183 180 197 200 211 225 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z

Josef Chudoba

OBSAH

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků způsoby měření spekter Rozlišovací schopnost spektrometru Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii Typy hmotnostních spektrometrů Součásti hmotnostního spektrometru – iontový zdroj separátor iontů vakuový systém způsob dávkování vzorku

Hmotnostn í spektrometrie (Mass Spectrometry – MS)

Analytická technika pro analýzu organických sloučenin Kvalitativní analýza – identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny) Kvantitativní analýza – sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích Ale i sledov ání obsahu kovů (ICP MS) Speciální aplikace pak např. ISOTOPE RATIO MS Podstatou MS je detekce vzorku při IONIZACI – jedná se o destruktivní metodu – vzorek je při analýze znehodnocen

nabitých částic

(iontů), které vznikají z molekul

VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT ?

VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT

V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin Od vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru

CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA

1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny) 2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br) 3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny 4) Je li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny

Hmotnostní spektrum

Intenzita

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100

[ M + H ] +

734.4691

Molekulový resp. pseudomolekulový ion

Magnet EI+ 6.35e12

Izotopické příspěvky

735.4691

0 731 732 733 734 735 736 736.4769

737 738 739 mass m/z

Osa x:

m/z – hmotnost iontu dělena jeho nábojem

Osa y:

intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor – je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru – nejvyšší pík má výšku 100 %

Hmotnostní spektrum

Režim záznamu dat

centrovaný (centroid) – především u GC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar „čáry“ kontinuální (continous) – u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku O

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100

[ M + H ]

734.4691

735.4691

736.4769

H 3 C H 3 C OH OH O H 3 C CH 3 O CH 3 O CH 3 OH CH 3 H O O O O H 3 C N CH 3 H 3 C O CH 3 CH 3 CH 3 Magnet EI+ 6.35e12

Erythromycin

OH 0 07_Blazek_PO5_1 (15.245) Is (1.00,1.00) C37H68NO13 100 734.4691

Magnet EI+ 6.35e12

0 731 732 733 734 735 735.4725

736 736.4753

737 737.4780

738 739 mass

MOLEKULOVÁ HMOTNOST

Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da) 1 Da = 1 amu (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12 C 1 Da = 1,660 338 782 x 10 -27 kg Molekulová hmotnost – hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka amu) Molární hmotnost – hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol) číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné

monoisotopická

v praxi počítána z hmotností nejstabilnějších (nejvíce zastoupených izotopů prvků),

průměrná

zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků

nominální

– zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost

MOLEKULOVÁ HMOTNOST

bromobenzene Br

V MS spektrech vždy MONOISOTOPICKÁ hmotnost

100 Nominal Mass = 156 Da Monoisotopic Mass = 155.957455 Da Average Mass = 157.0079 Da Molecular Formula = C 6 H 5 Br benzene 50 51 12 27 38 0 10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo 60 70 77 Br 156 90 104113 110 128 130 143 150 170 78 100 Nominal Mass = 78 Da Monoisotopic Mass = 78.04695 Da Average Mass = 78.1118 Da Molecular Formula = C 6 H 6 50 15 0 10 20 (mainlib) Benzene 26 30 39 40 51 50 60 63 70 74 80 90

Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru

1) Jaká ionizační technika byla při měření použita

tvrdé ionizační techniky – vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí měkké ionizační techniky – malá nebo skoro žádná fragmentace

2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno

hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) – v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů hmota s přesností na desetinná místa

3) Jaký experiment

(MS vs MS/MS nebo IN SOURCE fragmentace MS)

Rozlišovací schopnost spektrometru (R) – jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností

R = m/

m m … m/z iontu,

m . . . rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů

Různé definice rozlišení: „valley“ definice vycházející s překryvu píků „FWHM“ (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku

Převzato z materiálu Fischer Scientific

VYSOKÉ rozlišení (HIGH RESOLUTION)

Jsou li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou

[ M + H ] +

Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná?

Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů – chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace

Chyba při měření hmoty (

m acc )

 D

m acc (ppm) = 10 6 x

m acc / m TRUE

m acc = m MEASURED m TRUE

Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku

Hmotn ostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité IONIZAČNÍ TECHNICE

IONIZACE –

tvrdá

(vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů) Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 70 eV /

EI + 70 eV

/ rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek – databáze spekter (NIST, WILLEY) V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů) IONIZACE –

měkká

(dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly) Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách Elektrosprejová ionazace /

ESI

/. chemická ionizace za atmosferického tlaku /

APCI

/ kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů)

MALDI

(Matrix Assisted Laser Desorption) – pro vysokomolekulární sloučeniny

Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum

GC/MS analýza efedrinu

Informace

z MS spektra – zastoupení izotopů prvků

Prvek

Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě

Izotop % rel.

Uhlík Vodík Dusík Kyslík Síra Chlor Brom 12 C 1 H 14 N 16 O 32 S 35 Cl 79 Br 100 100 100 100 100 100 100 13 C 2 H 15 N 17 O 33 S 1,11 0,016 0,38 0,04 0,78 18 O 34 S 37 Cl 81 Br

A prvky

A+2 prvky A+1 prvky F, I, P, H(vzhledem k nízké intenzitě A+1) 0,20 4,40 32,5 98,0

1 ul, split 1:20 1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br2 100 160 5.00e12

Br 2 07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br 100 78.9183

80.9163

5.07e12

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (12.550) Is (1.00,1.00) Cl2 100 70 5.74e12

72 Cl 2

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl 100 34.9689

7.58e12

158 162

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br3 100 239 241 3.80e12

0 150 160 170 mass 237 243 Br 3 36.9659

74 0 66 68 70 72 74 76 78 80 mass

1 ul, split 1:20

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl3 100 105 4.35e12

107 Cl 3 0 70 75 80 85 90 mass

Br I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1

0 230 235 240 245 250 mass 0 25 30 35 40 45 mass

Cl I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1

109 0 100 111 110 120 mass

100 50 25 32 38 43 51 56 61 0 20 30 40 50 (mainlib) Benzene, chloro 60 77 100 Cl 112

m/z 77 45,3 % m/z 112 100 % m/z 113 6,9 %

77 70 74 80 84 90 97 100 110 120 130

m/z 114 32,9 %

50 51 12 27 38 0 10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo 60 70 Br 156 90 104113 110 128 130 143 150 170

m/z 77 100 % m/z 156 61,8 % m/z 157 4,1 % m/z 158 59,8 %

77 100 204 I 50 51 27 37 60 0 20 40 60 (mainlib) Benzene, iodo 80 100 127 120 140 152 160 176 180 200 220

m/z 77 100 % m/z 204 74,5 % m/z 205 4,4 %

100

A:m/z 78 100 % A+1:m/z 79 6,5 %

78 Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn)

 50 15 0 10 (mainlib) Benzene 20 26 30 100 39 40 40

A:m/z 154 100 % A+1:m/z 155 12,9 %

50 51 49 53 50 60 63 70 74 80 90 154 27 0 20 30 (mainlib) Biphenyl 39 40 51 50 60 63 70 76 80 89 90 102 100 110 115 120 128 130 139 140 150 160 170

(

 1 ) * 1 , 1 * 100

)

Molekulový ion v hmotnostním spektru

Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché

EI+ 70 eV

u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra)

ESI

– tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů

APCI

– možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji) Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní

EI+ 70 eV:

Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zak čas) ázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost – vyšší bod varu – delší retenční

ESI

: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů

Chemická pravidla: Dusíkové pravidlo

Dusík – m= 14 Da, třívazný prvek žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo lichý počet atomů dusíku v molekule -> molekulov á hmotnost látky je LICHÉ číslo EI+70 eV

0 nebo sudý počet

N: m/z molekulového iontu

sud é

m/z fragmentů

liché

číslo číslo

lichý

počet N: m/z molekulového iontu

liché

m/z fragmentů

sudé

číslo číslo

ESI+: 0 nebo sudý počet

N: m/z [M+H] + iontu

liché

číslo

lichý počet

N: m/z [M+H]+ iontu

sudé

číslo

ESI-:

0 nebo

sudý počet

N: m/z [M-H] iontu

liché

číslo

lichý počet

N: m/z [M-H]- iontu

sudé

číslo

Chemická pravidla: Počet kruhů a dvojných vazeb – Rings + Double Bonds (R + DB)

Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly

R+DB = C – ½ H + ½ N +1

C = počet čtyřvazných atomů – C, Si H = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F … (halogeny) N = trojvazných atomů N, P, As Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, O), ale třeba DMSO – síra je čtyřvazná 1 kruh Příklad: fenol C 6 H 5 OH

**R+DB = 6 –1/26+1/20+1 = 4 Aromáty : R+DB = minimálně 4**

3 dvojné vazby

Využití R+DB a

dusíkového

pravidla EI+ 70 eV: Celočíselná hodnota R+DB

 

může být molekulový ion ion s lichým počtem elektronů Neceločíselná hodnota R+DB

 

nemůže být molekulový ion ion se sudým počtem elektronů

Využití při strukturní analýze

Elementární analýza z High Res MS spektra

V ždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum – org. látky C, H, N, O, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení)

ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA

O H 3 C H 3 C OH OH O H 3 C CH 3 O CH 3 O CH 3 OH CH 3 H O O O O

Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry

H 3 C N CH 3 CH 3

Erythromycin C Mw monoiso C max = 52, H max 37 H 67 NO 13 = 734,4691 Da Příklad vstupní parametry: = 106, N max = 15, O max = 15

1 – 3

ppm

H 3 C O CH 3 CH 3 Výsledek: navržené kombinace C x H y (N z ,O z ,S z …) OH

Přesnost měření - chyba hmoty (ppm

) 10 5 2 1

38 výsledků 17 výsledků 9 výsledků 4 výsledky

Aplikace „chemických“ pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací !! – řešeno softwarově

Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny?

GC/MS

Elektronová ionizace (EI+ 70 eV)

v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-CO- (teplotně labilní)

Chemická ionizace (CI)

v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) – většinou pouze na vybrané typy sloučenin LC/MS

Elektrosprejová ionizace (ESI)

sloučeniny – pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové

Atmosferická chemická ionizace (APCI)

pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze) ale při vyšší teplotě než ESI, sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu

MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI)

pevné matrice vzorku laserem – vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny) – ionizace vzorku v přítomnosti

Existuje celá řada dalších ionizačních technik – cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována.

Jak velké molekuly lze analyzovat

Zdroj: Agilent Technologies

Jak velké molekuly lze analyzovat GC/MS LC/MS

Kvadrupol (Q) Iontová past (IT) V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1000 – 2000, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)

GC/MS LC/MS

TOF (Time of Flight)

LC/MS

ORBITRAP Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 40000), maximální m/z a ž 500 kDa, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter) měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~100000), maximální m/z ~ 4 kDa, pomalejší frekvence sběru dat (spekter)

GC/MS

Magnetický sektor měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~40000), maximální m/z ~ 2000, pomalejší frekvence sběru dat (spekter),

Přístroje hybridní – umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů) GC/MS LC/MS

Tripple Quad (QQQ) Trojitý quadrupol

LC/MS

Q-TOF

LC/MS

Ion Trap – ORBITRAP Quadrupol – Time Of Flight iontová past - Orbitrap nebo IT-TOF

Jak velké molekuly lze analyzovat ?

MALDI 100 - 1000 kDa ESI až 100 kDa TOF ORBITRAP APCI až 2 kDa EI+ 70 eV / CI až 1 - 2 kDa ION TRAP QUADRUPOLE

Schéma hmotnostního spektrometru Inlet

Plynový chromatograf Kapalinový chromatgraf Direct Insertion (Infussion) Probe MALDI destička

Iontový zdroj

Ionizační techniky: EI+, CI, APCI, ESI, MALDI

Analyzátor

Iontový separátor Detektor vakuum

Režimy snímání dat: MS experiment

SIM (SIR)

Intenzita

TIC

m/z čas

Full SCAN (Total Ion Current TIC)



cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z Rekonstruovaný chromatogram (RIC) ion a vykreslí se



z TICu se vybere požadovaný chromatografický záznam Selected Ion Monitoring (SIM)



cyklicky se snímají jen vybrané ionty



citlivější než TIC režim

např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí:



TIC řádově ng (10 –9 g)



SIM řádově pg (10 (10 -15 g) –12 g) až fg

Re žimy snímání dat: MS/MS experimenty

Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad Detektor Iontový zdroj Kolizní cela

Product Ion Scan:

Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce

Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS 2 ); Ion Trap (až MS 10 ) s vyšším MS n klesá citlivost!

Precursor Ion Scan:

Q1:TIC (m/z 1 – m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce

Instrumentace: nelze na Ion Trap

Constant Neutral Loss Scan:

Q3: TIC ((m/z 1 D N) – (m/z 2 D N)) detekce; odpadající neutrální částice z iontu Q1:TIC (m/z 1 – m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu D N – rozdíl hmotností iontů – hmotnost Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap

Selective Reacrion Monitoring (SRM):

iontu Q3: SIM detekce Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)

Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité …

Cena, provozní náklady, účel využití !!!

Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS

Technické parametry:

Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů) Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z) Rychlost scanování (počet scanů/s) Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu) Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení) Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje) Vakuum (je li třeba vyšší stupeň vakua – vyšší cena)

Požadavky na instalaci:

Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné) Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TOP) x velké (hmotnost > 500 kg) Plyny – např. LC-MS průtok N 2 kapalného N 2 až 500 l/min – nutný generátor N 2 nebo zdroj

MS - iontový zdroj a ionizační technika

Electron Impact (EI + 70 eV) – elektronová ionizace nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu moleku lového iontu pohybuje okolo 10 eV



70 eV přebytek energie dostatečný pro tvorbu moleku lového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter EI+ dnes běžně ve spojení s GC Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze Ionizace probíhá ve vakuu Schéma EI+ ionizačního zdroje

MS - iontový zdroj a ionizační technika

ESI (Electrospray)

V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na) + ionizace probíhá za atmosferického tlaku

MS - iontový zdroj a ionizační technika

APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku)

V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty zmlžovacího plynu (N 2 ) , mobilní fáze a analytu. Ionty plynu reagují s molekulami mobilní fáze a vzniklé ionty předají náboj analytu.

MS - iontový zdroj a ionizační technika

Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI.

U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu – nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód

APCI – první komerční využití – 1986 oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace ESI – první komerční využití – 1988 2002 – Nobelova cena za chemii: John Bennett Fenn Kompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli

MS - iontový zdroj a ionizační technika

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption)

Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě „pevné směsi“ matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TOF analyzátorem. Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek m M roztok, matrice 100 mM roztok Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H) + , (M+K) + , (M+Na) + NELZE spojit s HPLC!!!

Spotovac í destička

Zdroj:Agilent Technologies

MS - separátory iontů

lineární kvadrupol



konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat. Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadru polem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z

MS - separátory iontů

Iontová past (ion trap)



účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou.

Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách



s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru

MS - separátory iontů

Průletový analyzátor (time of flight TOF)



K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru.

je tvořen prázdnou trubicí.

Nutná konstatantní stabilní teplota - st

Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později.

Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí.

MS - separátory iontů

Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole



umožňuje prostorové

m

z



B

r

2 2 .

V

V ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech



dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti

ORBITRAP

MS - separátory iontů

Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do Orbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat – generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum

elektroda Octapole Osa z



konst

m

z

MS - detektor iontů

detektor



separátorem zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony a ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení.

Fotonásobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.

MS - vakuum

EI+ 70 eV, CI, MALDI – vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány) Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua 1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy – vakuum cca 10 -2 mBar – slouží pro provoz pump 2. stupně vakua

MS - vakuum

2. Stupeň vakua cca 10 -5 až 10 -8 mBar (1 mBar = cca 100 Pa) turbomolekulární pumpa difuzní olejová pumpa

MS - způsob vnosu vzorku

EI+ 70 eV: GC/MS – kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet) evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) – vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lock ESI, APCI: LC/MS – mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje) Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje