Transcript lab dg invazivnih gi

Cilj nastave:
1.






Principi LDg PGI:
dlake
nokta
kože
sluzokože
oka
uva
3. Metode
identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM
 Difuzija
 Dilucija
 Etest
2. Principi




4.
LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija,
ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA)
invazivna kandidijaza (IC)
zigomikoze
Pneumocystis pneumonija
Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata
Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze
Mikotoksini i mikotoksikoze
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE
DIJAGNOZE GI
STANDARDNE MIKOLOŠKE
METODE
(KONVENCIONALNE METODE)
1. MIKROSKOPSKI PREGLED
BOLESNICKOG MATERIJALA
 direkni mikroskopski preparat(DMP)
 patohistologija (PH)
IMUNOLOŠKE METODE
DOKAZIVANJE ANTITELA (At)
DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
2. IZOLACIJA GLJIVA IZ
BOLESNICKOG MATERIJALA
 m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)
“z l a t n i s t a n d a r d”
DOKAZANA GI
VEROVATNA/MOGUĆA GI
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE
IGI
“non culture” metode – izbor za LDg IGI
IMUNOLOŠKE METODE
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE At
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
DOKAZIVANJE Ag gljiva
STANDARDNE MIKOLOŠKE
METODE
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
(KONVENCIONALNE METODE)
•
HEMOKULTURA NA GLJIVE
•
BIOPSIJA
Problem: retko pozitivne,
invazivna metoda
uzorkovanja, spore
Problem: interpretacija
nalaza At kod
imunodeficijentnih osoba
Problem: lako moguća
kontaminacija uzoraka
Nisu standardizovane
Prednost: DOKAZANA IGI
Prednost: Rana Dg IGI
Senzitivne
Brze
Prednost:Rana Dg IGI
Visoko senzitivne
Brze
Nova strategija dijagnoze IGI*
tkivo
Faktori
domaćina
+
Klinička
slika
+
Faktori
domaćina
+
Klinička
slika
+
+
Klinička
slika
Faktori
domaćina
=
Dokazana IGI
Mikologija
=
Verovatna IGI
Negativna
Nije
radjena
=
Mikologija
Moguća IGI
Faktori
domaćina
Negativna
+
Mikologija
=
*EORTC/MSG kriterijumi
Idealan dijagnostički test
•
•
•
•
•
•
Senzitivan i specifičan
Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)
Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)
Jednostavan
Jeftin
Brz
Zašto “non cultural” metode (detekcija biomarkera)???
Principi testova
Zašto
biomarkeri?
• Antigeni and
antitela
se lakše otkrivaju nego
same gljive
Antitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišu
Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju
Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu
Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine
Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:
zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka
Biomarkeri gljiva i “non culture” metode
Strukture gljiva
Candida
Ćelijski zid
Mannans
1,3--D-glucans
chitin
Citoplazmatska
membrana
Enolase
HSP-90
Metaboliti
arabinitol
DNK/RNK
C-14 lanosterol
demethylase
Chitin synthase
Actin
Aspartate proteinase
Ribosomal RNA
Aspergillus
Galactomannan
1,3--D-glucans
chitin
Metode
LA
ELISA
RIA
Amebocid lizat
Spectrofotometrija
ELISA
Immunoblot
D-mannitol
GLC
Mas. spektroskop.
C-14-lanosterol
demethylase
Alkaline protease
Mitochondrial DNA
HSP-90
Ribosomal RNA genes
PCR
“Non cultural” metode (aglutinacija, imunodifuzija, ELISA)
Principi Ag-At testova
Lateks aglutinacija (LA) – princip testa
Antigen Test
+
Latex obložen At
Uzorak
(+) Ag gljiva
Aglutinat
Antibody Test
+
Latex obložen Ag
Uzorak (+) At
na gljiva
Aglutinat
Lateks aglutinacija (LA) – primena
Primena testa – detekcija Ag:
Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)
Manan – Candida Ag (IK**)
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Primena testa – detekcija At:
Anti-galaktomanan-At
Anti-manan-At
Anti-glukuroksilomanan-At
LA – interpretacija nalaza
*Invazivna aspergiloza
** Invazivna kandidijaza
Imunodifuzija (ID) – princip testa
Immunobiology, 4th Edition
Concentration
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Concentration
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Imunodifuzija (ID) – primena
Primena:
aspergiloza (Ag, IgG)
subkutane mikoze (Ag, IgG)
endemske mikoze (Ag, IgG)
Pozitivan nalaz - precipitacija
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich
ELISA
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich
ELISA
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Add Specimen
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Sandwich
ELISA
Add Specimen
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich ELISA
princip testa - detekcija Ag
Add Specimen
Containing Ag
Primena testa:
•
•
Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)
Manan – Candida Ag (IK)
•
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
(Specimen)
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija Ag
(Specimen)
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
Primena testa:
•
•
•
•
anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)
anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG
anti-Cryptococcus IgM, IgG
Specifična At pri sumnji na endemske mikoze
“Non cultural” metode (PCR)
Principi PCR testa
PCR ZA DIJAGNOZU IGI NIJE
STANDARDIZOVAN!!!
Uzorci:
• krv
• serum
• tkivo
• BAL
• CSF
Protokoli
• DNK ekstrakcije
• PCR dizajn
• Amplifikacije
Primena:
Aspergiloza
Kandidijaza
Pneumocistis pneumonija
Species/genus
specifične sekvence
• HSP 90
• Lanosterol
• demethylase
• chitin synthase
• aspartic proteinase
• actin
Automatizovan metod izdvajanja DNK
gljiva iz krvi
Ekstrakcija DNK
•
Automatizovana
•
Trajanje testa 16 h - 4 h
•
In vitro osetljivost (1cfu/ml)
Kontaminacija (problem)
•
tokom ekstrakcija
•
tokom izvođenje testa
•
tokom priprema proba
•
tokom priprema reagenasa
Okolina!!!
Metode patohistologije u dijagnozi IGI
Specijalna bojenja na gljive
GLJIVE - specijalna bojenja (HP)
H&E:
Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor
Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva
Gomori methenamin silver (GMS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: tamno braon – osnova zelena
Periodic acid-Shiff (PAS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena
Mucin (mucicarmin):
Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva
Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze
Fontana-Masson:
Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina
Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla
Gljive – histopatologija (HP)
GMS
H&E
Hope et al., Lancet Infectious Diseases 5: 609, 2005
Gljive – histopatologija (HP)
Pluća (mucikarmin)
Pluća (PAS)
Gljive – imunohistopatologija (IHP)
Imunohistohemija (mAt)
WF-AF-1 (Dako)
EB-A1 (Dako)
Choi JK, Am J Clin Pathol 121: 18, 2004
Pneumocystis jirovecii - Gimza
Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)
BAL, biopsija plućnog tkiva