lab dg invazivnih gi
Download
Report
Transcript lab dg invazivnih gi
Cilj nastave:
1.
Principi LDg PGI:
dlake
nokta
kože
sluzokože
oka
uva
3. Metode
identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM
Difuzija
Dilucija
Etest
2. Principi
4.
LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija,
ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA)
invazivna kandidijaza (IC)
zigomikoze
Pneumocystis pneumonija
Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata
Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze
Mikotoksini i mikotoksikoze
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE
DIJAGNOZE GI
STANDARDNE MIKOLOŠKE
METODE
(KONVENCIONALNE METODE)
1. MIKROSKOPSKI PREGLED
BOLESNICKOG MATERIJALA
direkni mikroskopski preparat(DMP)
patohistologija (PH)
IMUNOLOŠKE METODE
DOKAZIVANJE ANTITELA (At)
DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
2. IZOLACIJA GLJIVA IZ
BOLESNICKOG MATERIJALA
m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)
“z l a t n i s t a n d a r d”
DOKAZANA GI
VEROVATNA/MOGUĆA GI
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE
IGI
“non culture” metode – izbor za LDg IGI
IMUNOLOŠKE METODE
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE At
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
DOKAZIVANJE Ag gljiva
STANDARDNE MIKOLOŠKE
METODE
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
(KONVENCIONALNE METODE)
•
HEMOKULTURA NA GLJIVE
•
BIOPSIJA
Problem: retko pozitivne,
invazivna metoda
uzorkovanja, spore
Problem: interpretacija
nalaza At kod
imunodeficijentnih osoba
Problem: lako moguća
kontaminacija uzoraka
Nisu standardizovane
Prednost: DOKAZANA IGI
Prednost: Rana Dg IGI
Senzitivne
Brze
Prednost:Rana Dg IGI
Visoko senzitivne
Brze
Nova strategija dijagnoze IGI*
tkivo
Faktori
domaćina
+
Klinička
slika
+
Faktori
domaćina
+
Klinička
slika
+
+
Klinička
slika
Faktori
domaćina
=
Dokazana IGI
Mikologija
=
Verovatna IGI
Negativna
Nije
radjena
=
Mikologija
Moguća IGI
Faktori
domaćina
Negativna
+
Mikologija
=
*EORTC/MSG kriterijumi
Idealan dijagnostički test
•
•
•
•
•
•
Senzitivan i specifičan
Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)
Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)
Jednostavan
Jeftin
Brz
Zašto “non cultural” metode (detekcija biomarkera)???
Principi testova
Zašto
biomarkeri?
• Antigeni and
antitela
se lakše otkrivaju nego
same gljive
Antitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišu
Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju
Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu
Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine
Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:
zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka
Biomarkeri gljiva i “non culture” metode
Strukture gljiva
Candida
Ćelijski zid
Mannans
1,3--D-glucans
chitin
Citoplazmatska
membrana
Enolase
HSP-90
Metaboliti
arabinitol
DNK/RNK
C-14 lanosterol
demethylase
Chitin synthase
Actin
Aspartate proteinase
Ribosomal RNA
Aspergillus
Galactomannan
1,3--D-glucans
chitin
Metode
LA
ELISA
RIA
Amebocid lizat
Spectrofotometrija
ELISA
Immunoblot
D-mannitol
GLC
Mas. spektroskop.
C-14-lanosterol
demethylase
Alkaline protease
Mitochondrial DNA
HSP-90
Ribosomal RNA genes
PCR
“Non cultural” metode (aglutinacija, imunodifuzija, ELISA)
Principi Ag-At testova
Lateks aglutinacija (LA) – princip testa
Antigen Test
+
Latex obložen At
Uzorak
(+) Ag gljiva
Aglutinat
Antibody Test
+
Latex obložen Ag
Uzorak (+) At
na gljiva
Aglutinat
Lateks aglutinacija (LA) – primena
Primena testa – detekcija Ag:
Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)
Manan – Candida Ag (IK**)
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Primena testa – detekcija At:
Anti-galaktomanan-At
Anti-manan-At
Anti-glukuroksilomanan-At
LA – interpretacija nalaza
*Invazivna aspergiloza
** Invazivna kandidijaza
Imunodifuzija (ID) – princip testa
Immunobiology, 4th Edition
Concentration
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Concentration
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kuby Immunology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Imunodifuzija (ID) – primena
Primena:
aspergiloza (Ag, IgG)
subkutane mikoze (Ag, IgG)
endemske mikoze (Ag, IgG)
Pozitivan nalaz - precipitacija
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich
ELISA
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich
ELISA
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Add Specimen
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip
testa - detekcija
Ag gljiva
Sandwich
ELISA
Add Specimen
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Sandwich ELISA
princip testa - detekcija Ag
Add Specimen
Containing Ag
Primena testa:
•
•
Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)
Manan – Candida Ag (IK)
•
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
(Specimen)
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija Ag
(Specimen)
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Princip testa - detekcija At
Primena testa:
•
•
•
•
anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)
anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG
anti-Cryptococcus IgM, IgG
Specifična At pri sumnji na endemske mikoze
“Non cultural” metode (PCR)
Principi PCR testa
PCR ZA DIJAGNOZU IGI NIJE
STANDARDIZOVAN!!!
Uzorci:
• krv
• serum
• tkivo
• BAL
• CSF
Protokoli
• DNK ekstrakcije
• PCR dizajn
• Amplifikacije
Primena:
Aspergiloza
Kandidijaza
Pneumocistis pneumonija
Species/genus
specifične sekvence
• HSP 90
• Lanosterol
• demethylase
• chitin synthase
• aspartic proteinase
• actin
Automatizovan metod izdvajanja DNK
gljiva iz krvi
Ekstrakcija DNK
•
Automatizovana
•
Trajanje testa 16 h - 4 h
•
In vitro osetljivost (1cfu/ml)
Kontaminacija (problem)
•
tokom ekstrakcija
•
tokom izvođenje testa
•
tokom priprema proba
•
tokom priprema reagenasa
Okolina!!!
Metode patohistologije u dijagnozi IGI
Specijalna bojenja na gljive
GLJIVE - specijalna bojenja (HP)
H&E:
Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor
Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva
Gomori methenamin silver (GMS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: tamno braon – osnova zelena
Periodic acid-Shiff (PAS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena
Mucin (mucicarmin):
Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva
Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze
Fontana-Masson:
Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina
Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla
Gljive – histopatologija (HP)
GMS
H&E
Hope et al., Lancet Infectious Diseases 5: 609, 2005
Gljive – histopatologija (HP)
Pluća (mucikarmin)
Pluća (PAS)
Gljive – imunohistopatologija (IHP)
Imunohistohemija (mAt)
WF-AF-1 (Dako)
EB-A1 (Dako)
Choi JK, Am J Clin Pathol 121: 18, 2004
Pneumocystis jirovecii - Gimza
Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)
BAL, biopsija plućnog tkiva