Transcript Introduktion till ADH

Alkoholdehydrogenas – ADH labb
Biokemi 1 – HT-11
Linda Helmfors
[email protected]
([email protected])
Dehydrogenaser
• Enzymer som katalyserar överföring av väte kallas med ett
samlingsnamn för dehydrogenaser
• Alkoholdehydrogenas (ADH) katalyserar oxidation av alkoholer
-> aldehyder
• ADH kräver närvaro av koenzymet NAD+ för aktivitet
• ADH är ett gruppspecifikt enzym. Snabbast reaktion med etanol
men även andra alkoholer fungerar
ADH
2
NAD+
Labben
• Blanda olika alkoholer med ADH och NAD+
• Mäta absorbansändringen
• Beräkna reaktionshastigheten
3
Reaktionen vi studerar
ADH-NAD+ + R-CH2OH ⇌ ADH-NADH + R-CHO + H+
4
Hur kan vi mäta reaktionshastigheten?
• Vi kan mäta reaktionshastigheten genom att mäta
spektrofotometriskt vid 340nm
• NADH absorberar ljus till skillnad från NAD+
• 1 mol NADH  1 mol alkohol
• Absorbansökningen per tidsenhet är ett mått på
reaktionshastigheten
DA Abs30s - Abs10s
DA
=
Þ
min-1
Dt
(30 -10) / 60
Dt
5
Reaktionshastighet
• E mättat på [S]
• Allt E förekommer som [ES]
• [E]Tot = [ES]
• VMax beror av [E]
Under dessa beting
mäter vi
6
Absorbans jämfört med reaktionshastighet
Konstant
hastighet
DA
Dt
Ger oss hastigheten i min-1 men vi vill ha µmol/min
7
Överskottet
substrat är slut
=> Reaktionen
har nått jämvikt
Beräkningar
• Lambert-Beers lag:
A = e ×l × c
• A
absorbansenhet
• ε
ämnesspecifik konstant, här för NADH 6,22 ∙ 103 M-1 cm-1
• l
strålens väg genom kyvetten i cm
• c
koncentration av NADH i kyvetten i M
• Kan skrivas om:
DA
Dc
=e ×l ×
Dt
Dt
8
Beräkningar forts.
DA
Dc
=e ×l ×
Dt
Dt
æ DA ö
ç ÷
Dc è Dt ø
=
Dt
e ×l
Detta vill vi göra om till mol/min
Dc
mol
× kyvettvolym(L) Þ
Dt
min
Skriv sedan i µmol/min i tabellen
9
M/min
Laborationsredogörelse:
• Rubrik: Laborationens namn
• Resultat:
•
Rådata (invägda mängder, spädningar, direkta mätresultat ) tydligt
redovisade, gärna i tabellform:
Alkohol
10
Mängd
ADH
Absorbans
1
Absorbans
2
Tid 1
Tid 2
•
Redovisade uträknade resultat baserade på mätdata – Tydligt!
•
Graf över reaktionshastigheten som funktion av enzymmängden
Laborationsredogörelse forts:
•
Ifylld tabell över resultat
Substrat
ADH
(µl)
ADH
(mg)
∆A/∆t
(min-1)
v
(µmol/min)
v100/vetanol
• Resultattolkning/Diskussion: Värdering av resultat och egna
slutsatser samt svar på eventuella frågor ställda i
laborationshandledningen.
• Lathund över vanliga returer kommer att sitta uppe på labb
11
Kommentarer till returer - ADH
1.
Beräkningarna behöver justeras
2.
Grafen saknar enheter/fel enhet
3.
Uppdatera tabellen och grafen
4.
Utvecka diskussionen över resultatet
5.
Redovisa beräkningarna med exempel från egna värden
6.
Graf saknas
7.
Tabell över rådata saknas
8.
Diskussion saknas
Förberedelser
• Läs labbhandledningen innan labben
• Fundera över:
13
•
Vilka data behöver vi samla in för att beräkna V?
•
Vad förväntar vi oss för resultat?
Labben i korthet
1. Reaktionen utan enzym: NAD+ + EtOH, blanda -> mät
2. Reaktionen med enzym: NAD+ + EtOH + ADH, blanda snabbt
-> mät
3. Upprepa för reproducerbarhet
4. Upprepa (2) med olika volym ADH
5. Upprepa med olika alkoholer
14
Vi ses på labb!