Transcript 20508013_EnzimologiPresentasi

Klasifikasi, Mekanisme dan
Aplikasi Enzim DNA Ligase
Abdul Arifin
20508013
1
Klasifikasi DNA Ligase
Nomenclature Committee of the International Union
of Biochemistry and Molecular Biology
(NC-IUBMB)
Enzim Nomenklatur
DNA Ligase (ATP)
Struktur molekul
Sisi Aktif (Lysine)
EC.6.5.1.1
Definisi;
DNA Ligase: salah satu enzim ligase yang membentuk
ikatan kovalen fosfodiester diantara ujung 3’Hidroksi
dari satu nukleotida dengan ujung 5’fosfat dari
nukleotida yang lain dan melibatkan ATP dalam
reaksinya.
Mekanisme Reaksi
Secara Umum;
(DNA)n + (DNA)m
(DNA)n+m
DNA Ligase
ATP
AMP + Ppi
Mekanisme DNA Ligase
Suatu rantai
DNA yang terpisah
NH-AMP
DNA ligase
Transfer gugus adenosil
ke ujung 5’ PP1
NMN
fosfat pada DNA yang terpisah
E.coli
T4
Gugus hidoksil menyerang ujung 5’
+
ATP
fosfat – adenosil - NAD
enzim
NH2
AMP
DNA ligase
Ligated DNA
Pembentukan intermediate enzim
energi tinggi dengan transfer gugus
adenosil dari NAD+ atau ATP pada
gugus amino dari residu lysine
3
Tipe-tipe DNA Ligase
Pada Hewan Mamalia terdapat 4 tipe spesifik dari enzim DNA Ligase,
diantaranya ;
• DNA Ligase I : yang mengkatalis reaksi ligasi fragmen-fragmen
Okazaki pada pemanjangan rantai sewaktu proses replikasi DNA
berlangsung dan beberapa fragmen-fragmen rekombinasi
• DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang
ditemukan pada sel yang tidak dapat membelah diri
• DNA Ligase III : Bentuk kompleks dengan XRCC1 suatu protein
yang memperbaiki DNA dengan mencegah terjadinya mutasi
penghilangan basa DNA dan fragmen-fragmen rekombinan
• DNA Ligase IV : Bentuk kompleks dengan XRCC4. Kompleks enzim
ini mengkatalisis tahap akhir proses perbaikan penggabungan ujung
non-homolog DNA rantai ganda.
Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam
T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.
Regulator DNA Ligase
Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun
oleh Debbie Creissen dan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982)
Nuclear ADP-ribosyl transferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribos dari NAD+
ke protein Kromatin untuk membentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi.
Enzim ini sangat tergantung DNA untuk aktivitasnya dan diaktivasi dengan adanya celah
dalam DNA. Hal ini mengindikasikan biosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkan untuk
perbaikan yang efektif untuk beberapa jenis kerusakan DNA.
Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of
polyethylene glycol yang disusun oleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikan dalam
Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631
Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhi reaksi ligasi pada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v)
larutan PEG 6000, hanya ligasi intermolekular yang dipertinggi oleh kation-kation
monovalent, sementara reaksi ligasi inter- dan intramolekular dapat terjadi tanpa PEG.
Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicans
Disusun oleh Andaluz, E., et. al., yang dipublikasikan dalam Yeast volume 15 issue 12,
1999, p1199-1210
menjelaskan tingkat transkripsi enzim CaLIG4 dalam C. albicans bervariasi selama siklus
sel ragi. Sel-sel yang baru terbentuk mengandung tingkat transkripsi basa yang meningkat
sampai tingkat maksimum ketika sel dalam keadaan G1 akhir. Sesudah itu, tingkat
ranskripsi menurun ketika replikasi DNA dimulai.
Isolasi dan Karakterisasi DNA Ligase
Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591
Denaturasi
Annealing
pisahkan gen DNA ligase menjadi DNA
rantai tunggal dengan pemanasan 94oC
selama 1 menit
gabungkan primer ke rantai tunggal
DNA, dengan suhu 50oC/140 detik
Primer merupakan urutan daerah dari DNA ligase
organisme x
Extension
pembentukan rantai ke dua dengan DNA
polymerase dan dNTP pada suhu 72oC selama
1,5 menit
Dilakukan PCR sampai 40 siklus,
Fragmen yang dihasilkan (total
panjang 600nt), yang mirip dengan
gen DNA ligase organisme x
DNA Thermococcus sp. 1591
Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591
Primer 1 and 2
Membentuk gen utuh.
Gen DNA ligase utuh
Karakterisasi DNA Ligase
Aktivitas ligase dapat ditentukan melalui dua metode
Salah satu sampel ditambahkan
DNA ligase
1.Molekul DNA kontrol
2. DNA setelah penambahan enzim restriksi BstEII
3. Sama seperti 2, tetapi sebelum elektroforesis sampelnya
dipanaskan 70oC selama 10 menit
4. Sampel fragmen DNA + BstEII dengan penambahan
DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksi serta ATP
5. Mirip dengan 4 tetapi tanpa ATP
C = produk ligasi (fragmen A + B)
A dan B= fragmen hasil restriksi BstEII
Aplikasi DNA Ligase
Percobaan pertama DNA rekombinan
•
•
1971 ilmuwan memanipulasi DNA
dan menempatkannya ke dalam
bakteri
1972 ilmuwan menggabungkan dua
molekul DNA dari sumber berbeda
menggunakan endonuclease EcoRI
(untuk memotong) dan DNA ligase
(untuk menggabungkan kembali)
Aplikasi DNA Ligase
Kloning DNA pertama
Boyer, Helling Cohen, dan Chang
menggabungkan fragmen-fragmen
DNA dalam sebuah vector, dan
mentransfer ke sel E. coli
Cohen and Chang menyimpulkan,
mereka dapat menempatkan DNA
bakteri ke dalam spesies bakteri
yang berlainan
Tahun 1980 Boyer and Cohen
menerima paten untuk metode
dasar transformasi dan kloning
DNA
Aplikasi DNA Ligase
DNA ligase dimanfaatkan untuk menggabungkan secara kovalen ikatan
fragmen-fragmen suatu DNA, secara luas kemampuan ini diaplikasikan ke
penggabungan suatu fragmen DNA pada suatu vektor plasmid, hal ini
merupakan teknik dasar rekombinasi DNA
Organisma Modifikasi Genetik: Aplikasi DNA Ligase dalam Agriculture
Agrobacterium
DNA mengandung
gen yang diinginkan
1
Ti
plasmid
Pemasukan gen
ke dalam plasmid
menggunakan
T DNA
enzim restriksi
dan DNA ligase
Titik restriksi
Plant cell
2
Rekombinan
Ti plasmid
pengenalan
ke dalam sel
tanaman yang
dikembangkan
3
Regenerasi
tanaman
T DNA
pembawa
gen baru
dalam
kromosom
tanaman
Tanaman hasil
rekayasa
Perkembangan Aplikasi
DNA Ligase
E. coli
1 Isolat DNA
Sel Manusia
dari dua sumber
2 Potong kedua
Plasmid
DNA dengan
enzim restriksi
yang sama
DNA
Gen V
Sticky ends
3
Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119)
Klon DNA : (teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik)
1. Potong DNA pada posisi tertentu dengan enzim restriksi
endonuklease.
2. Gabungkan kedua fragmen DNA dengan DNA ligase.
3. Pilih molekul kecil yang mampu mereplikasi DNAnya sendiri.
Potongan DNA dapat dimasukkan ke dalam kloning vektor
(plasmid atau viral DNA) untuk membentuk DNA rekombinan.
4. Pindahkan DNA rekombinan dari tabung tes ke sell induk
untuk replikasi.
5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan.
campurkan DNA; mereka
bergabung berdasarkan
pasangan basanya
4 DNA ligase menggabungkan
ikatan DNA secara kovalen
Gen V
5
Rekombinan DNA
plasmid
plasmid dimasukkan ke
bakteri
6 bakteri diklon
Klon bakteri mengandung duplikat
gen manusia
“Beras Keemasan” telah dimodifikasi secara
genetik agar meengandung beta-karotene
Beras ini dapat menolong
mencegah terjadinya defisiensi
terhadap vitamin A
Kloning Sel-sel Hewan,
Langkah menuju gen terapi
Tanaman tembakakau,
diekspresikan dengan
gen firefly luciferase
Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan
dengan gen HGH (Human Growth Hormone)
Sel-sel dan organisme rekombinan digunakan untuk
menghasilkan protein-protein yang bermanfaat
Kesimpulan