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Tecniche di separazione e purificazione dei composti organici
I composti organici, sia di origine naturale che prodotti in laboratorio mediante sintesi chimica, si trovano
spesso miscelati ad altre sostanze dalle quali devono essere separati.
SOSTANZA NATURALE presente in una data matrice biologica, per ottenere il composto allo stato puro, è
necessario estrarlo dalla matrice, separarlo e purificarlo dagli altri composti eventualmente presenti.
PRODOTTO DI SINTESI CHIMICA, può essere necessario rimuovere il solvente, gli eventuali reagenti in
eccesso, il catalizzatore e/o i possibili prodotti collaterali della reazione.
Tecnica
Stato di
aggregazione
Proprietà
chimico-fisica
Distillazione
Liquido
Punto di
ebollizione
Cristallizzazione
Solido
Solubilità
Estrazione con
solventi
Liquido/Solido
Ripartizione tra fasi
Cromatografia
Liquido/Solido
Ripartizione tra fasi
Tecniche di
purificazione:
estrazione
Estrazione
L’estrazione è un processo di trasferimento di uno o più composti da una fase (solida o liquida), nella quale
sono sospesi o disciolti, ad una diversa fase (liquida o gassosa) immiscibile con la prima.
I metodi di estrazione con solventi vengono molto usati in campo farmaceutico per l’isolamento del
principio attivo da:
•droghe grezze (foglie, semi , corteccia, fiori,..)
•tessuti e liquidi biologici (sangue, urine, contenuto gastrico, etc..)
•preparazioni galeniche (polveri, compresse, capsule..)
Ripartizione H2O/solvente organico
Quando un composto X , viene messo in un imbuto
separatore, con due liquidi immiscibili, come H2O e
DCM,
esso si ripartisce o distribuisce tra i due
liquidi.
La quantità di X in ciascuna fase dipende dalla sua
solubilità relativa in H2O e DCM
X
H2O
Definiamo coefficiente di partizione o di distribuzione
K, il rapporto tra le concentrazioni di X in ciascuna fase
K
(Xfase fi nale)org
(Xfase i ni zi ale)acq

[X]org
[X]acq
X
DCM
Ripartizione H2O/solvente organico
-se K=1, il soluto si ripartisce equamente tra le due fasi, e non è possibile condurre una separazione per
estrazione selettiva.
Il valore di K deve necessariamente essere maggiore di 1.
-se K>1, (sostanze lipofile), il soluto si concentra nella fase organica e può essere estratto
efficacemente.
-se K<1, (sostanze idrofile), il composto organico è più solubile in H2O che nei solventi organici e solo una
piccola quantità potrà essere estratta. K potrà essere alterato per aggiunta di un sale inorganico, p.es.
NaCl, alla fase acquosa: la sostanza organica sarà meno solubile nella soluzione di NaCl che in acqua e
l’estrazione nel solvente organico sarà più efficiente.
L’aggiunta di NaCl solido nell’imbuto separatore è una tecnica chiamata “salatura”.
Coefficiente di Partizione e Lipofilia
La
LIPOFILIA
di una sostanza descrive la sua tendenza a sciogliersi in un solvente apolare,
come l’etere o il cloroformio, piuttosto che in acqua.
Il n-ottanolo e l’acqua costituiscono la coppia standard di solventi utilizzata per determinare i
coefficienti di ripartizione dei farmaci. In genere si adopera il logaritmo decimale del coefficiente di
ripartizione (logP).


[X]n-ottanolo 

log P  log
 [X]

acqua 

In base al valore di logP possiamo classificare le sostanze in tre categorie:
 idrofobiche o lipofile o apolari, con logP > 0

 idrofile o polari, con logP < 0
 di media polarità, con logP intorno a 0
Coefficiente di Partizione e Lipofilia
Lipofili
Media polarità
N
OH
O
O
O
O
Atropina
logP= 1.8
O
Ac.benzoico
logP= 1.9
Idrofilia
Log P
Lipofilia
N
N
OH
OH
b-naftolo
logP: 2.70
Idrofili
N
N
Caffeina
logP=-0.07
HO
O
O
OH
HO
O
OH
Acido citrico
logP: -1.72
La lipofilia di un soluto determina la sua capacità di attraversare le membrane
cellulari
I farmaci lipofili sono ben assorbiti dopo
somministrazione orale e si distribuiscono
nel SNC.
I farmaci idrofili, in genere, sono assorbiti
poco o per nulla e non raggiungono il SNC
Un farmaco che attraversa una
membrana cellulare deve essere
sufficientemente lipofilo
Gli acidi e le basi deboli sottoposti a ripartizione tra due
solventi non miscibili partecipano a due equilibri
simultanei:
1) quello di ripartizione della specie neutra tra la fase acquosa
e la fase organica
FO
HA
HA logP
HA
pKa
pH
H+ + AFA
2) quello acido-base che ha luogo esclusivamente nella fase acquosa
Il primo equilibrio dipende dal coefficiente di ripartizione (P) del soluto. Il secondo equilibrio
dipende dal pKa del soluto e dal pH della fase acquosa.
La ripartizione complessiva che risulta dai due equilibri è espressa
dal coefficiente di distribuzione (D) o, più frequentemente, dal logD.
.
Coefficiente di ripartizione apparente o
rapporto di distribuzione (D)
D =
[HA] nella fase organica
[HA] nella fase acquosa
[HA] o
=
[HA] a + [A-]a
= P
Coefficiente di Distribuzione
Il LogD è correlato al LogP ed al pKa dalle seguenti equazioni:
[HA]ORG
P=
[HA]ACQ
[H+] +[A-]
KA =
[HA]
D=
[HA]ORG
[HA]ACQ +[A-]
Dividendo numeratore e denominatore di D per [HA]acq e usando Ka e P si ottiene
la relazione che lega D a P, Ka e pH
P
D=
KA / [H+] + 1
Si può osservare come la capacità estrattiva per una dato P e un dato
pH aumenti all’aumentare del valore di pKa, ossia quanto meno forte è
l’acido. Inoltre, per una dato pKa, la capacità estrattiva è massima e
uguale a P per valori di pH molto minori di pKa, dove l’acido è presente
quasi totalmente nella sua forma indissociata, e minima per valori di pH
molto maggiori di pKa, dove l’acido si può considerare totalmente
dissociato. In quest’ultimo caso il logD decresce linearmente con
l’aumentare del pH.
Coefficiente di Distribuzione
P
D=
KA / [H+] + 1
Il LogD è correlato al LogP ed al pKa dalle seguenti equazioni:
D
[H  ]KD
[H ]  Ka


 logDpH  logP  log 1  10( pH pKa )

Acidi deboli


D
KaKD
[H ]  Ka

Basi deboli




logDpH  logP  log 1  10( pKa pH )

Coefficiente di Distribuzione
O
OH

logDpH  logP  log 1  10( pH pKa )

pH neutro l’acido carbossilico si
trova in entrambe le forme
dissociata e indissociato quindi si
ripartisce tra le fase D(10-1,28
=0,052)
logP: 1.90
pKa: 4.22

logD (pH 7.4): 1.90 - log [1+103.18] ≈ - 1.28
pH acido l’acido carbossilico
è tutto indissociato quindi si
troverà più in fase organica
D alto (101,90 = 79 )
logD (pH 1): 1.90 - log [1+10-3.22] ≈ 1.90
logD (pH 14): 1.90 - log [1+109.78] ≈ -7.88
pH
basico
l’acido
carbossilico si trova tutto
dissociato quindi tutto in
fase acquosa il D è basso
(10-7,88 = 0,00000000131 )
Coefficiente di Distribuzione
OH

logDpH  logP  log 1  10( pH pKa )

logP: 2.70
pKa: 9.83

logD (pH 7.4): 2.70 - log [1+10-2.43] ≈ 2.70
logD (pH 1): 2.70 - log [1+10-8.83] ≈ 2.70
logD (pH 14): 2.70 - log [1+104.17] ≈ -1.47
pH basico l’acido debole si
troverà più in fase acquosa D
alto (10-1,47 = 0,033 )
pH acido e neutro l’acido
debole si trova tutto in fase
organica il D è alto (102,70 =
501 )
 ESTRAZIONI LIQUIDO-SOLIDO: il soluto viene rimosso dalla matrice
solida attraverso un solvente.
 ESTRAZIONI LIQUIDO-LIQUIDO: il soluto viene trasferito in modo
selettivo da una fase liquida ad un’altra fase liquida immiscibile con la prima.
 ESTRAZIONI IN FASE SOLIDA: consente di estrarre un soluto da un
campione liquido o gassoso mediante un materiale solido adsorbente sul quale
il soluto viene selettivamente concentrato e, quindi, rimosso con quantità
minime di solvente.
Il composto da estrarre si trova all’interno di una matrice solida da cui viene
estratto per mezzo di un solvente e portato in soluzione. I componenti della
matrice che non si sciolgono vengono rimossi per filtrazione o centrifugazione.
La resa del processo di estrazione dipende da:
1) Scelta del solvente: deve avere polarità adatta a solubilizzare il soluto, ma
deve anche penetrare all’interno della matrice e rimuovere il soluto dai siti di
adsorbimento.
2) Trasferimento di massa: dipende dalla viscosità del mezzo, dal coeffieciente
di diffusione del soluto e dalla struttura della matrice.
3) Matrice: influenza il tipo di interazioni che si instaurano con il soluto.
Estrattore di
Soxhlet
Ditale di carta da filtro in cui si inserisce la miscela solida
VANTAGGI: Estrazione in continuo
Solvente estraente
SVANTAGGI:
 Richiede molte ore (12/24h)
 L’estratto non deve essere termolabile perché si
concentra nella caldaia ed è sollecitato ad alte
temperature
 Impiego di quantità considerevoli di solvente
 Estrazione poco selettiva
Estrazione liquido-liquido
L’estrazione liquido-liquido sfrutta la differente solubilità di una sostanza tra due solventi
immiscibili.
Il composto si distribuisce tra le due fasi fino al raggiungimento dell’equilibrio.
Equazione di Nerst
K=
[CA]
[CB]
=
[Co]
[Ca]
= P
Se K1/K2 > 100, è possibile separare due sostanze mediante una semplice
estrazione.
L’estrazione di un soluto, da una fase all’altra, è tanto meglio realizzabile
quanto più K si discosta da 1.
Per valori di K < 100 non è sufficiente una sola operazione di estrazione, per cui
l’operazione va ripetuta più volte con nuovo solvente estraente (estrazione in
discontinuo).
Estrazione con imbuto separatore
Estrazione con imbuto separatore
A
B
C
Si usa per:
▪ Purificare composti organici prodotti da una sintesi di laboratorio.
▪ Spostare una sostanza anche pura da un solvente altobollente (es. H2O) ad
uno avente un punto di ebollizione inferiore.
Scelta del solvente di estrazione
Dovendo eseguire diverse estrazioni successive, quando possibile, è più utile scegliere il solvente
in modo da lasciare la sostanza desiderata nella fase superiore, in modo che la fase di scarto sia
quella inferiore, più facile da separare. Per sostanze più solubili nella fase organica, è meglio
usare un solvente meno denso dell’acqua (etere etilico), e viceversa.
Inconvenienti:
La miscela delle due fasi è così scura che
l’interfaccia non è visibile: esporre ad
una fonte luminosa
E’ visibile solo uno strato: succede quando nella
miscela è presente una grande quantità di solventi
miscibili con l’acqua (EtOH, THF, etc). Questi
solventi si sciolgono bene sia in H2O che nel solvente
organico
Inconvenienti:
La miscela è chiara ma l’interfaccia non è visibile: si verifica
quando i due solventi hanno un indice di rifrazione molto
simile, per cui sembrano uguali. Aggiungendo un pizzico di
carbone, questo galleggerà sul liquido più denso
Si formano emulsioni quando goccioline di una soluzione
si sospendono nell’altra.
Le emulsioni non si separano per gravità!!!
Solventi come benzene, toluene, che trattengono molta
acqua formano facilmente emulsioni.
Le emulsioni vengono “rotte” per aggiunta di NaCl alla soluzione
Scelta del solvente di estrazione
Un solvente organico di estrazione deve possedere alcune caratteristiche:
•Immiscibilità con l’acqua
•Densità diversa dall’acqua
•Buon potere solvente
•Stabilità e volatilità (rimozione facilitata)
Un solvente ideale dovrebbe anche essere non tossico e non infiammabile
I solventi di estrazione possono essere divisi in due gruppi:
• solventi con densità maggiore dell’acqua (CH3Cl, CH2Cl2, CCl4)
• solventi con densità minore dell’acqua (Et2O, AcOEt, Esano, n-ottanolo)
Solventi per estrazione
Solvente
p.b.(°C)
Infiammabilità
Tossicità
Commenti
n-Esano
69
++++
+
Per composti apolari
n-Eptano
98
++++
+
Per composti apolari
Benzene
80.1
+++
+++++
Diclorometano
40
--
++
Forma emulsioni
Cloroformio
61.7
--
++++
Forma emulsioni
Etere etilico
34.5
++++
++
Assorbe molta
acqua
Etile acetato
77.1
+
+
Assorbe acqua
2-butanolo
99.5
+++
+++
Non usare
Per composti polari
Efficacia estrattiva:
Efficacia estrattiva:
nxKV o
e
V w  V oK
Esempio:
I)
VW=100 ml Vo=90 ml nx=10-2 mol K=10
Una sola estrazione con 90 ml:
102  10  90
e 
 9  103 moli
(100  90  10)
resa=90%
Efficacia estrattiva:
nxKV o
e
V w  V oK
Esempio:
VW=100 ml Vo=90 ml nx=10-2 mol K=10
II) Tre estrazioni da 30 ml:
102  10  30
e1 
 7.5  103 moli
(100  30  10)
2.5  103  10  30
e2 
 1.9  103 moli
(100  30  10)
nx  nxo  e1  2.5  103
nx  nxo  e1  e2  0.6  103
0.6  103  10  30
e3 
 0.45  103 moli
(100  30  10)
etot  e1  e2  e3  9.85  103 moli
resa=98.5%
Estrazione in continuo
Estrattore di Friedrichs: si usa quando la
soluzione da estrarre ha un solvente di densità
maggiore di quella del solvente da usare per
l’estrazione.
Estraenti più leggeri dell’H2O:
Etere etilico
Acetato di etile
Estrazione in continuo
L’estrattore di Cappelli si usa quando la
soluzione da estrarre ha un solvente di densità
minore del solvente da usare per l’estrazione.
Estraenti più pesanti dell’H2O: Cloruro di metilene
Cloroformio
Estrattore di Craig
Craig apparatus consists of a series of glass
tubes (r: 0, 1, 2..) so arranged that the lighter
liquid is transferred from one tube to the next.
All extractions are taking place simultaneously
in all tubes of the apparatus which is usually
driven electromechanically.
The lower phase of the heavier solvent (e.g.
water, blue layer in the picture) is the
"stationary phase", whereas the upper phase
of the lighter solvent (e.g. hexane, red layer in
the picture) is the "mobile phase".
ESTRAZIONE DISCONTINUA IN SERIE
Agenti disidratanti: per rimuovere tracce d’acqua
Agente
disidratante
Non adatto per
Acqua residua
mg H2O/L
g H2O/g
essiccante
azione
CaCl2
alcoli, ammine,
aldeidi, ammidi,
chetoni
0.14-0.25
0.2 (1H2O)
0.3 (2H2O)
idratazione
MgSO4
composti sensibili
agli
acidi
1.0
0.2 - 0.8
idratazione
Setacci
molecolari
molecole più
piccole
dei pori
0.18
adsorbimento
P2O5
Alcoli, acidi,
ammine,
chetoni
3x10-5
0.5
idratazione
12
1.2
idratazione
Na2SO4
Estrazione in fase solida (SPE)
L’analita viene adsorbito su una cartuccia per SPE utilizzando un solvente a basso potere eluente. Esso può
essere lavato con altri solventi a basso potere eluente (in grado di eluire le impurezze) e, quindi, viene eluito
con un piccolo volume di un solvente.
L’estrazione SPE è utile per allontanare sostanze interferenti nei casi in cui ciò è difficile da ottenere con
un’estrazione liquido/liquido. E’ ampiamente utilizzata in ambito biologico ed ambientale per aumentare la
concentrazione di tracce di analita.
Estrazione in fase solida (SPE)
Adsorbenti SPE
Adsorbenti polari (fase normale): la ritenzione degli analiti è legata
all’instaurarsi di forti interazioni tra i gruppi polari della fase solida
adsorbente e quelli dell’analita (interazioni dipolo-dipolo; dipolo-dipolo-indotto,
legami idrogeno), che devono essere superiori a quelle tra matrice ed analita.
Adsorbenti apolari (fase inversa): la ritenzione degli analiti si basa
sull’instaurarsi di interazioni apolari (forze di Van der Waals, forze di London)
fra analita ed adsorbente.
Adsorbenti a scambio ionico: sono caratterizzati dalla presenza di gruppi
permanentemente ionizzati in tutto l’intervallo di pH (scambiatori forti) o
ionizzati in un definito intervallo di pH (scambiatori deboli). L’interazione
avviene sulla base di interazioni elettrostatiche (attrazione tra cariche
opposte).
Adsorbenti a fase mista.
Vantaggi rispetto all’estrazione liquido-liquido:
• la natura chimica dell’adsorbente può essere variata in modo tale che esso
risulti essere selettivo per un particolare gruppo funzionale dell’analita;
• è possibile concentrare campioni diluiti;
• si utilizzano piccoli volumi di solvente sia in fase di lavaggio che di eluizione;
• tempi ridotti;
• la fase solida può essere riutilizzata dopo opportuni lavaggi (costi più limitati);
• possibilità di automatizzare il processo.
Limiti:
• è possibile che si verifichi adsorbimento irreversibile dell’analita.
• le colonne SPE a base di gel di silice sono instabili in condizioni fortemente
alcaline.
Ricapitolando: Estrazione
La procedura di estrazione permette di separare sostanze con solubilità
diverse.
Il coefficiente di partizione misura la ripartizione all’equilibrio di un
composto tra due fasi.
Il logP misura la lipofilia di un composto.
Per elettroliti deboli, il logD indica la distribuzione delle fasi in funzione del
pH e del pKa.
L’efficacia dell’estrazione aumenta col numero di estrazioni
Le tecniche di estrazione possono essere:
discontinue: singole (imbuto separatore)
in serie (estrattore di Craig)
continue:
liquido-solido (Soxhlet)
liquido-liquido (Friedrichs o Cappelli)
Test di autovalutazione:
separare le seguenti miscele di sostanze
CH3
OH
NH
N
+
O2N
CH3
in CHCl3
O
CH3
A: p-nitrofenolo
W: A-Na
3x NaOH 2N
CH3
B: lidocaina
Acidifica con HCl 2N
ed estrai con CHCl3
W: scarto
O: A, (LAS)
O: B (LAS)
LAS= Lavo con NaCl ss, Anidrifico su Na2SO4 anidro, porto a Secco il solvente
Test di autovalutazione:
separare le seguenti sostanze
O
O
OH
N
H
H2N
Cl
Cl
A
B
C
W: scarto
W: B-Na+
HCl 2N
CHCl3
3x NaOH 2N
O: A + C
3x HCl 2N
O: B, (LAS)
W: C+Cl- NaOH 2N
CHCl3
W: scarto
O: C, (LAS)
O: A, (LAS)
Test di autovalutazione:
separare le seguenti sostanze
CH3
O
OH
OH
CH3
O
H3C
O
A
B
C
W: scarto
W: A-Na+
HCl 2N
CHCl3
3x NaHCO3ss
O: B + C
3x NaOH 2N
O: A, (LAS)
W: B-Na+ HCl 2N
CHCl3
W: scarto
O: B, (LAS)
O: C, (LAS)
LAS= Lavo con NaCl ss, Anidrifico su Na2SO4 anidro, porto a Secco il solvente
Test di autovalutazione:
separare le seguenti sostanze
H2N
O
OH
C
NH2
HO
N
A
CH3
B
C
W: B porto a secco o concentro e cristallizzo
H2O, CHCl3
O: A + C
3x HCl 2N
W: C+Cl- NaOH 2N
CHCl3
W: scarto
O: C, (LAS)
O: A, (LAS)
LAS= Lavo con NaCl ss, Anidrifico su Na2SO4 anidro, porto a Secco il solvente