Transcript x lez tecniche purificazione cromatografia

Tecniche di
purificazione:
cromatografia
Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che
hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti,
per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo.
Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale
dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase
stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce
in continuo attraverso la fase fissa
TECNICHE CROMATOGRAFICHE
IN BASE ALLA FORMA DEL LETTO CROMATOGRAFICO
Cromatografia su colonna
Cromatografia planare (su strato sottile)
IN BASE ALLO STATO FISICO DELLA FASE MOBILE
Cromatografia liquida (LC)
Gascromatografia (GC)
IN BASE AL MECCANISMO DI SEPARAZIONE
Adsorbimento
Ripartizione
Scambio ionico (IEC)
Esclusione (SEC)
Affinità
NASCITA DELLA CROMATOGRAFIA
Inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti
fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett.
Egli intendeva separare i
pigmenti presenti nella
clorofilla; fece un estratto
di foglie verdi in etere di
petrolio, lo depositò in
testa ad una colonna di
vetro
impaccata
con
carbonato di calcio ed eluì,
(cioè versò in continuo)
solfuro di carbonio.
I vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla
A e B, carotene e xantofilla
Egli intuì che la separazione era dovuta alla diversa affinità dei
componenti per il carbonato di calcio
Un alto valore di K indica una maggiore affinità per la
fase stazionaria (C). il composto si sposterà più
lentamente lungo la colonna
Un basso valore di K indica una maggiore affinità per
la fase mobile (A). il composto si sposterà più
velocemente lungo la colonna
Grazie a questo avviene la separazione dei tre
componenti
C
B
A
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
K : fattore di capacità
α : Selettività
N : efficienza del sistema
R : risoluzione
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
K : fattore di capacità
Il fattore di capacità di un composto è il suo volume di eluizione
(tempo) rispetto al volume di eluizione (tempo) di un composto non
trattenuto
K=
(Rtanalita - Rtnon trattenuto)
Rtnon trattenuto
Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del
tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase
mobile durante il passaggio attraverso la colonna. Maggiore è il fattore di capacità
maggiore è il tempo trascorso in fase stazionaria e più tardi il composto eluirà dalla
colonna.
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
K=
(Rtanalita - Rtnon trattenuto)
Rtnon trattenuto
Volume morto: Il tempo o volume di eluizione di un composto che è non
trattenuto, cioè che non interagisce affatto con la fase stazionaria
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
α : Selettività
α=
k2
k1
Selettività: rapporto dei fattori di capacità di due picchi eluenti
La selettività misura le differenze di interazione tra i composti e la fase stazionaria
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
N : efficienza del sistema (piatti teorici)
Efficienza: misura l’affilatezza del picco eluente dalla colonna. E’ espressa come il
numero di piatti teorici della colonna.
Il numero di piatti teorici si calcola come il rapporto tra il tempo di ritenzione
dell’analita diviso per l’ampiezza del picco a metà altezza, tutto al quadrato e
moltiplicato per 5,54.
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
R : risoluzione
Misura la bontà della separazione tra due picchi eluenti.
R=
(tR(B) – tR(A))
0,5 (Wb(A) + Wb(B))
E’ calcolata come la differenza tra i tempi di ritenzione di due picchi divisa per
l’ampiezza media dei due picchi alla linea di base
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
ASIMMETRIA DEL PICCO
La forma del picco è un indicatore importante delle prestazioni cromatografiche.
A= b/a
Dove a e b sono le distanze della curva
dalla verticale tracciata nel punto massimo
del picco, misurate in corrispondenza del
10% dell’altezza del picco, rispettivamente
a destra e a sinistra del punto massimo.
I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA
Dipendenza della Risoluzione da Fattore di capacità,
Selettività ed Efficienza
Efficienza: La larghezza
del picco è funzione
dell’efficienza. Maggiore è
l’efficienza,
più
stretti
risultano i picchi e, perciò,
migliore è la risoluzione
Selettività: La differenza
in ritenzione tra due
composti è funzione della
selettività. Maggiore è la
differenza delle interazioni
dei due composti con la
fase stazionaria, maggiore
la selettività e maggiore
la risoluzione
Fattore di capacità: Dato che la risoluzione dipende dalla selettività e che questa
non è altro che il rapporto dei fattori di capacità, allora la risoluzione è anche
funzione dei fattori di capacità.
INTERAZIONI SOLUTO-FASI
Le interazioni interazioni che si verificano tra le sostanze da
separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se
così non fosse non ci sarebbe eluizione.
Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni interazioni:
 legami a idrogeno
 interazioni dipolo-dipolo
 interazioni dipolo-dipolo indotto
 Forze di Van der Waals
 Interazioni steriche
In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due
fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo
cromatografico
Alcuni materiali possono fungere da adsorbenti di analiti come ad esempio la silice
(gruppi Si-OH). Per l’eluizione viene scelto un eluente con polarità più vicina
all’analita più polare presente nella miscela (es.alcol come eluente di analiti che
contengono gruppi ossidrilici)
Idrossiapatite (Ca5(PO4)3OH Utilizzata per separare
DNA a singolo filamento dal doppio filamento. A basse
concentrazioni di tampone fosfato si legano entrambe le
specie; aumentando la concentrazione di tampone
viene desorbito selettivamente il DNA a singolo
filamento, aumentando ancora la concentrazione del
tampone viene rilasciato il DNA a doppio filamento)
Interazione idrofobica: sfrutta l’idrofobicità superficiale delle proteine per l’interazione
con gruppi alchilici (esile,ottile) o fenolici legati alla matrice. Tale cromatografia viene
utilizzata dopo il salting out con solfato d’ammonio per facilitare l’esposizione delle
regioni superficiali idrofobiche delle proteine e consentire l’adsorbimento alla fase
stazionaria.
L’eluizione dalla fase stazionaria avviene utilizzando forza ionica gradualmente minore,
o utilizzando un competitore che ha un’affinità maggiore della proteina per la fase
stazionaria
Cromatografia su colonna
Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria, in genere associata a una matrice
inerte e insolubile, è contenuta in una colonna di vetro, plastica o metallo. La fase mobile
passa attraverso quella stazionaria in seguito alla pressione generata per gravità dal
dislivello del liquido o a quella generata da un piccolo compressore. Le colonne
correntemente in uso sono corredate di valvole, rubinetti, sistemi di collegamento che ne
facilitano l’utilizzo. La tecnica è utilizzata sia per scopi analitici che preparativi.
In genere si procede nel seguente modo:
1 - Il miscuglio da separare è sciolto in un
opportuno solvente (fase mobile) e
stratificato sopra la fase stazionaria 2 - La
fase mobile è aggiunta dall'alto all'interno
della colonna 3 - I componenti della miscela
vengono trascinati dalla fase mobile con
velocità diverse e quindi iniziano a
separarsi 4 - Ogni componente del miscuglio
è raccolto separatamente. Prima verranno
raccolti i componenti adsobiti dalla fase fissa
più debolmente e poi via via gli altri.
Cromatografia
L’efficacia della separazione mediante colonna cromatografica dipende dalla corretta scelta del sistema
cromatografico: fase mobile, quantità e tipo di fase stazionaria, dimensioni della colonna. Un metodo ben
consolidato per acquisire tutte le informazioni per condurre una cromatografia su colonna efficace è la TLC.
Condizione indispensabile è però che il tipo di assorbente sulla TLC e nella colonna siano identici.
Vi sono varie ragioni per scegliere la TLC come tecnica per le analisi preliminari.
Infatti:
La TLC è rapida: vari solventi possono essere provati simultaneamente per scegliere la migliore fase mobile.
La TLC è facile da fare.
La TLC è economica: impiega pochissima sostanza e pochissimo tempo.
La TLC permette di identificare le sostanze per assorbimento UV (usando lastre con indicatore di
fluorescenza) o utilizzando reattivi di rivelazione.
Nella cromatografia su strato sottile (TLC), la fase stazionaria è contenuta in un sottile strato di matrice solida,
stratificata su una lastra di vetro, plastica o alluminio. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria per
capillarità in senso verticale.
Fase stazionaria
La silice, con varie porosità e dimensioni delle particelle, è l’adsorbente più
ampiamente usato; in alcuni casi si usano gel di alluminio o poliamidi.
Il gel di silice consiste in atomi di silicio e di ossigeno a formare reti tridimensionali.
Gruppi silossanici
Gruppi silanolici
Pori nella fase stazionaria
Le dimensioni delle particelle, la forma, la densità e la resistenza alla compressibilità
hanno un ruolo prominente nella permeabilità del letto, nella stabilità e nell’efficienza
della colonna. Più piccola è la particella adsorbente, migliore è la separazione, ma
anche maggiore la resistenza al flusso e il tempo necessario per effettuare una
completa separazione. Su scala da laboratorio, sono raccomandate dimensioni
delle particelle di 15-25 μm, 25-40 μm o 40-63 μm, che forniscono buona efficienza
di separazione e resistenza al flusso (contro-pressione) non troppo alta.
Fase mobile
La fase mobile è il paramentro più facilmente variato quando si ottimizza un
sistema cromatografico. Un eluente ideale deve:
• solubilizzare completamente il campione;
• essere trasparente all’UV alla lunghezza d’onda utilizzata dal rivelatore;
• se consiste di una miscela di solventi, si richiede che tali solventi siano miscibili;
• avere un basso punto di ebollizione, che assicura una procedura di recupero
facile, non aggressiva ed economica. Comunque, i solventi usati non dovrebbero
avere un punto di ebollizione troppo basso (Tb< 40°C), altrimenti potrebbero
evaporare già durante la separazione;
• avere bassa viscosità per minimizzare i problemi di “contropressione” della
colonna;
• avere stabilità e inerzia chimica in maniera da evitare la contaminazione o
modificazione del campione;
• avere bassa tossicità;
•Avere bassa infiammabilità;
•Avere basso costo.
Fase mobile: Serie eluotropica per il gel di silice
La forza del solvente è la proprietà di spostare una sostanza dai siti attivi della fase
stazionaria. Nel caso di un alcano, per esempio, questa proprietà è molto debole,
mentre nel caso del metanolo è molto pronunciata. Se i solventi vengono ordinati in
ordine crescente di forza, si ottiene quella che viene chiamata una serie eluotropica.
Frequentemente, un
esperimento
preliminare condotto
per cromatografia su
strato sottile fornisce
informazioni
utili
nella scelta della
fase mobile.
Esempio di buona separazione cromatografica
Cromatografia Flash
Granulometria della fase:
•Dimensioni delle particelle ( es. 0.2-0.3 mm)
•Intervalli di “mesh” ovvero numero di fori per
pollice lineare (2.54 cm) di un setaccio che trattiene
ovvero lascia passare completamente i granuli
della fase. ( es 70-230 mesh)
Rapporto in peso fase stazionaria/miscela
da 1:20-50 fino a 1:100-200 per separazioni
difficili
Diam
(mm)
10
20
30
40
50
Vol
el.
(mL)
Campione (mg)
Rf>0.2
Rf>0.1
100
200
400
600
1000
100
400
900
1500
2500
50
200
400
500
1000
Vol.fr
(mL)
5
10
20
30
50
Tecnica introdotta da Still nel 1978
W. C. Still, M. Kahn and A. Mitra, J. Org. Chem. 1978, 43,
2923.
Abbinare i composti alle macchie su TLC
Eluente 90/10 Esano/Acetato di Etile
H
HO
O
H3C
O
H
CH2
O
1
2
Cl
O
CH3
3
A
B
C
4
Soluzione: 1=D, 2=B, 3=C, 4=A
D
Quale miscela di eluenti è meglio utilizzare?
Eluente: esano (A) / Acetato di Etile (B)
75/25
90/10
95/5
98/2
1
2
3
4
5
Dipende dal prodotto che ci interessa isolare:
La miscela 95/5 è da preferire se vogliamo isolare il composto 1 o 2
La miscela 90/10 permette di separare i composti 3 e 4
La miscela 75/25 va bene per recuperare il composto 5
…RICAPITOLANDO
Tecnica
Stato di aggregazione
Proprietà chimicofisica
Distillazione
Liquido
Punto di ebollizione
Cristallizzazione
Solido
Solubilità
Estrazione con
solventi
Liquido/Solido
Ripartizione tra fasi
Cromatografia
Liquido/Solido
Ripartizione tra fasi