Biofilmu veidojošo S.epidermidis celmu noteikšana, izmantojot fenotipiskās un molekulārās bioloģijas metodes

Iveta Līduma, Tatjana Tračevska, Uģis Bērs, Aija Žileviča Latvijas Universitātes Medicīnas fakultāte Bioanalītisko metožu laboratorija Eiropas Sociālā fonda projekts “Kapacitātes stiprināšana starpnozaru pētījumos biodrošībā” Nr.2009/0224/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/055

• • • • Stafilokoki ir kļuvuši par vadošajiem nozokomiālo infekciju ierosinātājiem.

S.epidermidis bieži tiek izdalīts ar katetru lietošanu saistīto un ķirurģisko brūču infekciju gadījumos.

Stafilokoki labi adherējas pie medicīnā izmantojamo polimēru virsmām, veidojot biofilmas (protēzes, endotraheālās caurules u.c.) Biofilmas veidošana ir viens no svarīgākajiem virulences faktoriem.

• • • • Biofilmas veidošanās notiek vairākos etapos.

Viens no galvenajiem biofilmas veidošanās komponentiem ir PIA -polisaharīdu starpšūnu adhezīns, tā sintēzi kodē ica ADBC operons. Ar akumulāciju saistīto virsmas proteīnu AAP sintēzi nosaka gēns aap.

Gēni aap un icaA tiek izmantoti kā virulences marķieri.

Pētījuma uzdevumi

• • • Fenotipiski raksturot biofilmu veidošanos, audzējot in vitro biofilmu stimulējošos apstākļos. Ar molekulārās bioloģijas metodēm noteikt stafilokoku virulences faktoru gēnus – aap un icaA.

Salīdzināt invazīvo celmu mikroorganismu virulentās īpašības ar no veseliem cilvēkiem izdalītajiem

S.epidermidis.

• • • • Tika pārbaudīti 79 S.epidermidis paraugi.

59 bija klīniskie izolāti, kuri iegūti no pacientiem ar katetru lietošanu saistīto infekciju gadījumos (27), brūču infekciju (10) un bakterēmiju (22) gadījumos. No veseliem cilvēkiem iegūtie S.epidermidis 20 paraugi (iztriepes no deguna) tika iekļauti kontroles grupā.

References celmi S.epidermidis ATCC 12228 un S.epidermidis ATCC 35984 tika izmantoti kā kontroles.

S.epidermidis uz i/v katetra virsmas

Epifluorescentā m-sk. krāsots ar DAPI (100x) (1000 x)

S.epidermidis uz katetra virsmas

Sterils katetrs

palielinājums 1000 x palielinājums 100x

Congo red agars

• Ātrai un precīzai biofilmu veidojošo celmu noteikšanai tika izmēģināts Congo red agars ar 1% glikozes piedevu.

Biofilmu veidošana mikrotitru platē

krāsots ar 0.4% safranīna šķ.

Negatīvā kontrole Biofilmu veidojošie celmi Biofilmu neveidojošie celmi

• • •

Rezultāti

Starp klīniskajiem paraugiem abi gēni (icaA

+

un aap

+

) tika noteikti: asins paraugos 9 (40,9%), izolātos no brūcēm divos paraugos, no katetriem izdalītajos celmos 10 (37%). Kontroles paraugos (20) abi gēni tika noteikti vienā paraugā.

Kultivējot Congo red barotnē 79 stafilokoku celmus un pēc tam salīdzinot ar noteiktajiem virulences gēniem aap

+

un icaA

+

, saistība tika konstatēta 14 (17,7%) paraugos.

Rezultāti

• • Ar mikrotitru plates metodi tika pārbaudīti 47 celmi, analizējot rezultātus, konstatējām, ka biofilmu veidošanās mikrotitru platē 22 paraugos no hemokultūrām bija 8 (36,4%).

No 27 vēnu katetru paraugiem 14 (51,8%) gadījumos novēroja biofilmu veidošanos.

• • •

Secinājumi

Analizējot pētījuma rezultātus konstatēts, ka virulences faktori: gēni aap

+

un icaA

+

invazīvajos paraugos ir noteikti biežāk, salīdzinot ar kontroles grupas paraugiem.

Congo red agaru, lai diferencētu biofilmu veidojošos celmus, nav ieteicams lietot stafilokoku heterogenitātes dēļ. S.epidermidis virulences izpēte jāturpina, apvienojot molekulārbioloģiskās un fenotipiskās izmeklēšanas metodes.

• • Paraugi tiek ievākti, pateicoties sadarbībai ar laboratorijām no vairākām Rīgas un Latvijas slimnīcām: Rīgas Austrumu klīniskā universitātes slimnīca, Traumatoloģijas un ortopēdijas slimnīca, P.Stradiņa klīniskā universitātes slimnīca, Latvijas Infektoloģijas centra TPSK, Ventspils slimnīca.

Pateicamies RTU Ūdens pētījumu laboratorijas vadītājam Prof. Tālim Juhna un Mg.biol. Lindai Mežulei par atsaucību un iespēju izmantot tehnisko aprīkojumu.