Transcript 2_PAP_merit.ppt

Papanicolaoufarvningen
og
Cellemorfologi
Papanicolaou farvningen
Fiksering
96% ethanol
Hydrering
70%
Kernefarvning
Aluminium-hæmatein
Blåning
vand og natriumcarbonat
Dehydrering
70%
Cytoplasmafarvning
Orange G og EA 50 (eosin
og light green)
99% ethanol
Dehydrering og
montering
vand
96%
Hyppigst anvendte fikseringsmidler
• Til histologi
– Formalin (4% neutralbufferet)
• Gelerende
• Additiv
• Til cytologi:
– Alkoholfiksering og luftfiksering
• Koagulerende
• Ikke additiv
Formål med fiksering
1 Forhindre autolyse
2 Inaktivere mikroorganismer
3 Forhindre tab af cellekomponenter
Formål med fiksering
4 Stabilisere cellernes
form og struktur
• Celler fikseret på objektglasset
straks efter udstrygning
• Cellerne fikseret i suspension
• Cellerne er luftfikserede
Formål med fiksering
5
Gøre reaktive grupper i cellerne tilgængelig for farvestoffer og
efterlade de reaktive grupper med en ladning, så de farves
forskelligt med kation og anionfarvestoffer
Eksempel DNA:
Formål med fiksering
a: DNA + histon
i ufikseret celle
6
b: DNA + histon
i ethanol fikseret celle
Fikseringen skal være reproducerbar
Papanicolaou farvningen
Fiksering
96% ethanol
Hydrering
70%
Kernefarvning
Aluminium-hæmatein
Blåning
vand og natriumcarbonat
Dehydrering
70%
vand
96%
Cytoplasmafarvning Orange G og EA 50
(eosin og light green)
Dehydrering og
99% ethanol
montering
Papanicolaou farvningen
• Farvebindingsmekanismer:
– væsentligt betinget af tiltrækning mellem
modsat ladede ioniserede grupper i celler og
farvestof
– cellernes forskellige permeabilitet
– farvestoffernes partikelstørrelse
Papanicolaou farvningen
kernefarvning
Farver kerner, cytoplasma (afhængig af celletype) og mucus
Papanicolaou farvningen
Fiksering
96% ethanol
Hydrering
70%
Kernefarvning
Aluminium-hæmatein
Blåning
vand og natriumcarbonat
Dehydrering
70%
vand
96%
Cytoplasmafarvning Orange G og EA 50
(eosin og light green)
Dehydrering og
99% ethanol
montering
Papanicolaou farvningen
Cytoplasma
• Orange G
– anionfarvestof
• Fosforwolframsyre
– stor polyanionmolekyle
negativt ladet
Farver cytoplasmaet i keratinholdige celler orange
Papanicolaou farvningen
cytoplasma
• EA 50 farveopløsning
– Eosin (anionfarvestof)
– Light Green (farver
som et anionfarvestof)
– Fosforwolframsyre
(som i Orange G)
Eosin farver cytoplasmaet eosinofilt (acidofilt) i metabolsk inaktive celler
Light green farver cytoplasmaet i de metabolsk aktive celler (tillige med
Al-hæmatein) i blå-grønne nuancer
Papanicolaou farvningen
Fiksering
96% ethanol
Hydrering
70%
Kernefarvning
Aluminium-hæmatein
Blåning
vand og natriumcarbonat
Dehydrering
70%
Cytoplasmafarvning
Orange G og EA 50 (eosin
og light green)
99% ethanol
Dehydrering og
montering
vand
96%
PAP-farvningen
2
1
3
3
Konklusioner
• PAP-farvningen kræver alkoholfiksering
(vådfiksering) for optimal kvalitet
• Alkoholfiksering blotlægger mere DNA/RNA end
luftfiksering (granuleret kromatin)
• Alkoholfiksering skrumper og ”hærder” cellerne
• Cellerne svulmer op ved lufttørring/fiksering
• For kort alkoholfiksering før PAP-farvning giver
udvisket kromatin og hypokromasi
Cytologisk diagnose på
cervixcytologi
•
•
•
•
Mikroskopi ved x 100, x 200, x 400, x 600
Cellernes morfologiske udseende
Miljø/baggrund
Sammenholdt med relevante kliniske
oplysninger
Cytomorfologiske kriterier (se side 34)
Cellen
cellestørrelse og form
kerne/cytoplasma ratio (K/C-ratio)
lejring
Kernemembran
regelmæssig / uregelmæssig
opsplittet
fortykket
Cytoplasma
farvbarhed
intensitet af farven
struktur
Kromatinstruktur
intensitet af farvbarhed
kromatinfordeling
granulering
Kerne
størrelse
antal
placering
Nukleole
størrelse
form
antal
Celleform
• (a) intermediær pladeepitelcelle
– polygonal
– 1200/35 m2
– lille K/C ratio
fungerer som reference
b: superficiel pladeepitelcelle
Celleform
• metaplastiske celler
– rund
– 300 / 50 m2
Celleform
• cylinderepitel
– cylinderformet
– 180 / 50 m2
a: sekretorisk cylinderepitelcelle
b er en cilieret cylinderepitelcelle
Cellelejring
•
afhænger af prøvetagningen
– spontant afstødte celler i en cellesuspension
– afskrabede celler
•
afhænger af celletypen
– epitel celler
– non epiteliale celler
Enkeltliggende og Celleflager
Sheets
• enkelt lag med tydelige
cellegrænser
a
b
Syncytium
• cellehob med utydelige
cellegrænser
Cellebold
• 3-dimensionelle gruppe
(a)
b: granulocytter
(enkeltliggende celler)
c: erytrocytter
Mikrobiopsi
• store vævslignende
grupper
Cytoplasma
• Farvbarhed
– basofilt/eosinofilt
– amfofilt
• Intensitet af farven
– intenst
– svagere/transparent
Cytoplasma
• struktur
– homogent
– vakuoliseret
– granuleret/pigmenteret
Kernen
(tegnet af Lerckes tegnestue)
Kerne
• størrelse
– absolutte
– kerne/cytoplasma ratio
(K/C ratio)
• placering
– centralt
– excentrisk
• antal
– oftest en kerne
– bi-eller multinuklære
2
1
Kromatinstruktur
• intensitet af
farvbarhed
– normokromatisk
– hyperkromatisk
– hypokromatisk
Kromatinstruktur
• kromatinfordeling
• granulering
1
2
1
2
Kromatinstruktur
kromatinfordeling
granulering
Celler med nukleoler
• udtryk for
aktivitet/syntese af
r-RNA
• farves i en optimal
PAP-farvning rødlige
Miljø/baggrund
• Ren baggrund
Inflammation
Miljø/baggrund
• Mikroorganismer
Blodig
Miljø/baggrund
• Tumordiatese