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Universidade de São Paulo Bromatologia básica – FBA-201 Aspectos químicos e analíticos Gabriela Duarte Dias Luryê Soria Rafaela Rodrigues Samara Dias Nutrição Matutino 2013 Agenda • Introdução • Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis • Principais métodos de análises das vitaminas hidrossolúveis • Conclusão • Considerações Finais • Referências Introdução Vitaminas Hidrossolúveis Compreende a vitamina C e as vitaminas do Complexo B Encontradas em pequenas quantidades nos alimentos Facilmente absorvidas e excretadas pelo organismo Métodos de análise mais usados: CLAE, fluorimétrico, microbiológico Ácido ascórbico Vitamina C Formas encontradas Com atividade de vitamina C Ácido Lascórbico Ácido Ldehidroascórbico Sem atividade de vitamina C Ácido eritórbico Poderoso agente redutor o qual é oxidado muito rapidamente Sensibilidade Estabilidade Temperaturas elevadas Baixas temperaturas Soluções alcalinas Ausência de oxigênio Sem exposição à luz Tiamina Vitamina B1 • Propriedades físico-químicas Sensível ao calor e a basicidade Não é naturalmente fluorescente Pode sofrer oxidação na presença da riboflavina (vitamina B2) Riboflavina Vitamina B2 • Propriedades físico-químicas Encontrada como riboflavina livre, riboflavina-5-fosfato (FMN) e flavina adenina dinucleotideo (FAD) A riboflavina livre e as formas FAD e FMN são fluorescentes Sensível à luz e radiação UV Niacina Vitamina B3 • Propriedades físico-químicas Papel indispensável nas reações de óxido-redução no metabolismo da glicose, ácidos graxos, cetonas corporais e aminoácidos Nos alimentos, está presente como ácido nicotínico e nicotinamida Ácido nicotínico O triptofano é metabolizado a niacina Nicotinamida Piridoxina Vitamina B6 Formas encontradas Piridoxal Piridoxina Piridoxamina Sensibilidade Piridoxal-5fofato Piridoxamina-5fosfato Luz Estabilidade Meio ácido Temperatura até 120°C Cianocobalamina Vitamina B12 • Propriedades físico-químicas Grupo de estruturas complexas Sensibilidade Luz ultravioleta Forte luz visível Fortes agentes oxidantes Altas concentrações de agentes redutores Estabilidade Ar em temperatura ambiente Temperatura até 300°C (ponto de fusão) pH em torno de 4,5-5,0 Biotina • Propriedades físicas e químicas: É encontrada como vitamina livre e ligada a proteínas A biotina cristalina é bastante estável ao ar, luz solar e calor Formas ligadas podem tornar-se livres através de forte hidrólise ácida sob temperatura elevada ou com a ação de uma enzima proteolítica Em soluções fortemente ácidas e alcalinas a atividade biológica é destruída pela ação do calor Soluções aquosas de biotina são muito suscetíveis ao crescimento de fungos Método Microbiológico Ácido Pantotênico • Propriedades físicas e químicas: É instável ao calor em soluções alcalinas ou ácidas Sua forma pura é um óleo viscoso instável de caráter anfótero Ácido Fólico • Propriedades físicas e químicas: Na forma ácida é levemente solúvel em água Na forma de sal é bastante solúvel Atua como coenzima e processos de redução Método Fluorimétrico • Descrição do método: Técnica utilizada na determinação qualitativa ou quantitativa de substâncias nas quais ocorre o fenômeno Vitaminas analisadas pelo método Vitamina C Riboflavina (Vitamina B2) - Mais sensível e mais seletivo que outras técnicas - Muito caro - Difícil manuseio - (vitamina C) Não separa ácido ascórbico e dehidroascórbico Desvantagens Tiamina (Vitamina B1) Vantagens da fluorescência Método Microbiológico - Preço - Tempo - Relativamente - Pouca simples precisão Desvantagens Vantagens • Princípio: uso da vitamina como micronutriente essencial para microrganismos cultivados • De acordo com o crescimento da cultura de bactérias, determina-se a quantidade de vitamina da amostra • Pode ser usado para todas as vitaminas do complexo B • Algumas das espécies utilizadas são: Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei Método CLAE • Descrição do método: técnica utilizada para a separação dos componentes de uma mistura, através da distribuição dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel, pela afinidade das substâncias com cada fase. Vitaminas analisadas pelo método Tiamina (Vitamina B1) Riboflavina (Vitamina B2) Piridoxina (Vitamina B6) Ácido Fólico Ácido Pantotênico Biotina - Bons resultados - Alto custo do equipamento - Separa grande número de compostos de uma amostra em pouco tempo - Requer experiência do operador Desvantagens Niacina (Vitamina B3) Vantagens Vitamina C Método CLAE Cromatografia Normal Cromatografia de Fase Reversa Fase Estacionária Polar Apolar Fase Móvel Apolar Polar Compostos com maior tempo de retenção Polares Apolares Método Espectrofotométrico Vitamina analisada pelo método Vitamina C - Baixo custo -Boa sensibilidade - Mede as duas formas ativas da Vitamina C - Requer aplicação de artifícios para eliminar interferentes Desvantagem Vantagens • Descrição do método: Método analítico que se baseia na interação da matéria com a energia radiante • A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente Conclusão • O método CLAE é o mais utilizado para a análise de vitaminas hidrossolúveis apesar de seu alto custo • Existem métodos mais baratos que também são eficazes (ex: Microbiológico) Considerações Finais Os métodos nem sempre são eficazes: Mais de uma substância com atividade biológica da mesma vitamina Vitaminas presentes em pequenas quantidades nos alimentos Presença de substâncias interferentes Referências • GREENFIELD. H., SOUTHGATE, D.A.T. Food composition data: Production, management and use. 2ed. Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO), Rome, 2003. Cap 7: Review of methods of analysis (p. 127-147 ) • PENTEADO, M.V.C. Vitaminas: aspectos nutricionais, bioquímicos, clínicos e analíticos. Barueri: Manole, 2003 • SANTOS, Diego Ives de Vilas Boas; GIL, Eric de Souza. FLUORIMETRIA NA ANÁLISE FARMACÊUTICA: UMA REVISÃO. Revista Eletrônica de Farmácia, Goiânia, n. , p.01-16, 02 mar. 2010 Obrigada ! Método Fluorimétrico Vitaminas Ácido Ascórbico Vitamina C Tiamina Vitamina B1 Riboflavina Vitamina B2 Particularidades • Utilizado na ausência de ácido eritórbico • Oxidação: ácido ascórbico + ácido dehidroascórbico + ofenilenodiamina = derivado fluorescente • Mede as duas formas ativas do ácido ascórbico • Oxidação a tiocromo em meio alcalino, pois a tiamina não é naturalmente fluorescente • Apresenta fluorescência, portanto não há necessidade de derivatização Método Microbiológico Vitaminas Particularidades Tiamina Vitamina B1 • • Procedimento de extração de modo que a tiamina seja obtida na forma livre Lactobacilus fermentum Riboflavina Vitamina B2 • • • Lactobacilus casei Enterococcus faecalis Ensaio turbidimétrico Niacina Vitamina B3 • • Lactobacilus plantarum Não consegue diferenciar entre ácido nicotínico e nicotinamida Piridoxina Vitamina B6 • • Saccharomyces carlsbergensis É necessário que as vitaminas estejam na forma livre Cianocobalamina Vitamina B12 • • • Lactobacillus leichmanii Tamponamento Leitura da absorbância de luz UV Biotina • • Lactobacillus plantarum “Quantificação” através da turbidimetria ou da titulação Ácido Pantotênico • • Extração prévia com éter para retirar os ácidos graxos Lactobacillus plantarum Ácido Fólico Vitamina B9 • • Uso de ácido ascórbico Lactobacillus rhamnosis Método CLAE Vitaminas Particularidades Tiamina Vitamina B1 • Preferível detecção em fluorescência Riboflavina Vitamina B2 • Purificação do extrato antes da injeção do cromatógrafo Niacina Vitamina B3 • Não há particularidades Vitamina B6 • Resultados mais confiáveis e mais sensíveis do que o microbiológico Cobalamina Vitamina B12 Biotina • Não há particularidades • Extração preliminar com ácido seguido por tratamento com papaína