Transcript 141013 생명과학실험기법 (3618186)

Macro-molecule analysis
Analysis of amino acids and carbohydrates
Ionization constant of water
: equilibrium constant of water
altered by temperature
Kw = [H+][OH-]
temp, ℃
Kw
pH of water
0
0.114 x 10-14
7.47
10
0.292 x 10-14
7.27
20
0.681 x 10-14
7.08
25
1.01 x 10-14
7.00
40
2.92 x 10-14
6.77
At 25℃ and 1 atm, Kw = [H+][OH-] = 1.0 x 10-14
[H+] = [OH-] = 1.0 x 10-7 M
pH = - log[H+] = - log(10-7) = - (-7) = 7
Molar = mole/liter
mole
Kw = [H+][OH-] = 1 x 10-14 (at 25℃)
(ex) when [H+] is 10-1M, [OH-]는 10-13M
Q) What are [H+] and [OH-] when HCl is added to make 0.1 M HCl?
Before
After HCl is
added
[H+]
1 x 10-7
0.1
[OH-]
1 x 10-7
1 x 10-13
pH of HCl and NaOH solution
HCl
NaOH
Conc.,M
[H+]
[OH-]
pH
pOH
[H+][OH-]
pH+pO
H
1
1
10-14
0
14
10-14
14
0.1
0.1
10-13
1
13
10-14
14
0.01
0.01
10-12
2
12
10-14
14
0.001
0.001
10-11
3
11
10-14
14
1
10-14
1
14
0
10-14
14
0.1
10-13
0.1
13
1
10-14
14
0.01
10-12
0.01
12
2
10-14
14
0.001
10-11
0.001
11
3
10-14
14
Acid (산) and base (염기)
Definition of acid and base by Bronsted and Lowry
- Acid: a molecule donating proton (H+)
- Base: a molecule receiving proton (H+)
CH3COOH + H2O
산
CH3COO- + H3O+
염기
Acetate는 acetic acid의 짝염기
Acetic acid는 acetate의 짝산
염기
산
Comparison of acetic acid and acetate
Chemical form
Physical state
pH in solution
Acetic acid
CH3COOH
Transparent liquid
and sour taste
Acidic (산성)
Sodium
acetate
CH3COO-Na+
White powder and
crystal
Basic (염기성)
암모니아와 암모늄 염도 위의 경우와 마찬가지로
전자는 염기성 후자는 산성을 나타내는 완전히 다른 물질이다.
암모니아는 기체, 암모늄 염은 고체.
Titration curve of acetic acid
pH 2.4
Ka = 1.76 x 10-5
Henderson-Hasselbalch equation
Ka =
[H+]
[H+][A-]
= Ka
[HA]
[HA]
[A-]
-log[H+] = -log Ka - log
[HA]
[A-]
Ka = 5.6 x 10-10
Ka 값이 클수록
그리고
pKa 값이 작을수록 강산
Amino acids and Proteins
-
20 amino acids and peptide bond
Structure of proteins
Sequencing and synthesis of polypetides
Structure of amino acids
Except proline
a-amino acids
Stereoisomerism of Amino acids
enantiomers
L-amino acids are
usual form in living
organism
Absolute configuration
D,L system
(vs RS system)
Amino acids with Nonpolar R group
Hydropathy
index
-0.4
1.8
4.2
negative : hydrophobic
positive : hydrophilic
Imino group
Rigid structure
3.8
4.5
1.6
Alcohol/Sulfur-Containing Amino acids
-0.7
-0.8
2.5
Nonpolar thioether group
Cystine형성
1.9
Amino acids with aromatic R-group
2.8
-1.3
-0.9
UV light 흡수
1.82-2.38
8.8-10.96
imidazole group
pKa of side chains
10.53 12.48 6.00
guanidino group
중성 pH 근처의 pKa 값을
갖는 유일한 aa
/amides
-3.5
-3.5
-3.5
-3.5
Zwitterion
Base-Proton acceptor
Acid-Proton donor
Amphoteric
Ampholyte(amphoteric electrolyte)
Titration of glycine
Net charge
+1
0
-1
Isoelectric point:
Average of two pKa values
Effects of intramolecular interactions on pKa
pKa=-logKa Ka가 커지면 pKa는 작아짐.
강산일수록 그 conjugate base가 안정하다.
Titration curve of amino acid with ionizable side chain
+1
0
-1
-2
pI= avg of pK1 and pKR= 3.22
+2
+1
0
-1
pI=7.59
Function of leucine in obesity and insulin
resistance
Monosodium glutamate and “chinese
restaurant syndrome”- MSG allergy
MSG, a flavor enhancer
Dizziness, headaches, and
chest pain after taking
chinese meal
Due to impure materials in
fermented MSG, allergy is
developed. Still inconclusive.
Asparagine reduces hangover by activating
alcohol dehydrogenase
European patent- Asparagine and hangover
Soybean sprout soup.
Ionization behavior of peptide
Only one a-amino group and a-carboxyl group
pKa of peptide is different from individual amino acid
pI can be calculated.
실험 목적
아미노산의 정성 분석
미지의 아미노산을 적정하여 적정곡선을 그린 후 곡선으로부터 얻어진
pKa값을 통해 아미노산을 찾아낸다.
베네딕트 방법에 의한 환원당의 분석
베네딕트용액을 이용하여 생물체를 구성하는 탄수화물의 성질 분석과
화학적 구조에 따는 당의 환원성 여부를 관찰한다.
Introduction
아미노산 분석
Henderson-Hasselbalch pH=pKa + log [A-]/[HA]
[HA] = 산의 농도, [A-] = HA의 짝염기의 농도
[A-]=[HA] 일 때, 즉 산의 ½ 당량이 알칼리로 중화 되었을
때 pH=pKa이다.
Introduction
아미노산 분석
아미노산은 양쪽성 화합물로 산성기와 염기성기가
각 조건에서 해리한다.
NH3+ - CHRCOOH ↔ NH3+ - CHR - COO- +H+
pK1 (산성기)
NH3 - CHR - COO- ↔ NH3+ - CHR - COO- + H+
pK2 (염기성기)
아미노산이 양쪽성 이온(zwitterion)으로 존재하는
pH = pI (등전점)
pI = (pK1+pK2)/2
Materials & Methods
아미노산 분석
0.1M 아미노산, 1N HCl, 1N NaOH, 뷰렛, pH meter,
serological pipet, pipet aid, beaker, stirrer
1. 미지의 아미노산 용액 50ml을 비커에 넣고 보정한 pH meter로 pH를 측정한다.
2. pH가 1.3이 될 때까지 1N HCl을 조금씩 가해 주면서 pH를 측정한다.
3. pH meter의 전극을 증류수로 여러 번 씻어 보정한 후, 아미노산 용액의 pH가
12.5가 될 때까지 1N NaOH를 넣으면서 pH 측정한다. 이 때 뷰렛을 사용하여
NaOH를 넣어준다.
4. 각 시료용액의 적정곡선을 그린다.
[ X축 : OH- (equivalent), Y축 : pH ]
Results
아미노산 분석
적정곡선을 그려 pKa값을 구하고, 구한 값으로 사용된 아미노
산을 찾는다. 찾아낸 아미노산의 pH로부터 pI를 구한다.
대표적인 아미노산
Glycine, Histidine, Serine, Lysine, Glytamic acid, Aspartic acid
Carbohydrates and Glycobiology
Roles of Carbohydrates
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Energy source
ECM
Lubricant
Protection barrier
Cell-cell communication
Intracellular trafficking
Carbohydrates
The most abundant biomolecules on Earth
Many carbohydrates: (CH2O)n
Polyhydroxy aldehydes or ketones
Glycoconjugates
•
Carbohydrate polymers attached to proteins or lipids
Carbohydrates:
Classes of carbohydrates
•
•
•
Monosaccharides (simple sugar)
Oligosaccharides
- Disaccharides
Polysaccharides
Functional group: Aldose (-CHO) and Ketose (-C=O)
# of carbons:
triose (C3)
tetrose (C4)
pentose (C5)
hexose (C6)
heptose (C7)
Monosaccharides and
Disaccharides
Monosaccharide
• Unbranched carbon chain with 3 to 7 carbons
• Triose (3), tetrose (4), pentose (5), hexose (6), heptose (7)
• One carbonyl C & other carbons with hydroxyl group
• Aldose : carbonyl group is at the end  aldehyde group
• Ketose : carbonyl group is not at the end  ketone
Chiral Centers of Monosaccharides
• One or more asymmetric (chiral) carbon centers
 Optically active isoforms; optical isomers or enantiomers
• # of stereoisomers; 2n (n = # of chiral centers)
Chiral Centers of Monosaccharides (aldose)
•
L- or D-isomer
Depending on the configuration of the reference carbon
• D-isomer
• Reference carbon configuration is the same as D-glyceraldehyde
• -OH on the reference carbon; the right in the projection formula
• most hexoses of living organism
Chiral Centers of Monosaccharides (D-Ketoses)
Numbering C from the C nearest
the carbonyl group
Nomenclature of 4- and 5-carbon
ketoses
•Inserting ‘ul’ into the name of a
corresponding aldose
•Ribose  ribulose
Epimer
Two sugars that differ only in the configuration around
one C
Cyclic Structure of Monosaccharides
•
•
Formation of cyclic structure
Monosaccharides with 5 or more carbons (+ aldotetrose)
Formation of hemiacetals or hemiketals
- Reaction between alcohol and aldehyde
or ketone
Cyclic Structure of Monosaccharides
Generation of α or  isomers
•
•
•
Anomers
•
Mutarotation
•
D-glucose
•
•
•
Isomers differ only in the configuration of hemiacetal or hemiketal carbon
Interconversion of a and  anomers in aqueous solution
1/3 a-D-glucose
2/3 -D-glucose
Very small amount of linear and glucofuranose
Types of ring structure
•
•
Pyranose : 6-membered ring
Furanose : 5-membered ring
Conformation and Configuration
• Conformation of 6-membered pyranose
•
•
Not planar  2 “chair” conformations
Interconvertible without the breakage of covalent bonds
Monosaccharide are Reducing Agents
•
•
•
Reducing sugar
Sugars capable of reducing Fe3+ or Cu2+
Oxidation of carbonyl to carboxyl group
Only linear forms can be oxidized
•
Detection of glucose levels
Fehling’s reaction
•
Measuring the amount of oxidizing agent reduced by reducing sugar
Red cuprous oxide precipitate
under alkaline conditions
•
Using glucose oxidase
Glycogen and starch
Starch
• Amylose; D-glucose connected by α 14 linkages
• Amylopectin; α14 chains with α16 branches
•
•
•
•
Glycogen
α 14 chains with extensive α 16 branches
More compact than starch
Stored in liver (7% of wet weight) and skeletal muscle
Degradation from nonreducing ends
Introduction
-
당의 분석
단당류
: 둘 또는 그 이상의 히드록실기를 가진 알데히드 또는 케톤이다.
실험식은 (CH2O)n이고 삼탄당, 사탄당, 오탄당, 육탄당 등이 있으며,
대표적인 육탄당은 Glucose이다.
-
이당류
: O-글리코시드 결합으로 연결된 두 개의 당으로 구성된다.
풍부하게 존재하는 세가지 이당류로 sucrose(glucose+fructose),
lactose(galactose+glucose), maltose(glucose+glucose)가 있다.
-
다당류
: 단당류의 중합체로서 글리코겐, 녹말(아밀로스, 아밀로펙틴), 셀룰로오스
등이 있다.
Introduction
당의 분석
당의 환원성
당은 카르보닐 화합물의 형태를 가지고 있다. 단당류와 알데히드기를
가진 이당류는 Cu2+와 같은 산화제를 쉽게 환원시킨다.
Benedict용액은 황산구리, 탄산나트륨, 시트르산나트륨을 포함하고 있
으며, 용액 속에 있는 황산구리가 단당류 및 이당류와 반응하여 당을
침전시키고 색을 변화시킨다.
환원당의 색깔과 침전물의 양의 차이는 각각의 환원당의 환원력의 차
이에 의해 생긴다.
Materials & Methods
당의 분석
Glucose, Fructose, Sucrose, 전분용액, 베네딕트 용액, 증류
수, 시험관, vortex mixer, hot plate, pipet, tip
1. 각각의 시험관에 1%의 glucose, fructose, sucrose, 전분용액과 대조
용액인 증류수를 1ml 씩 넣는다.
2. 각 시료와 대조 용액에 베네딕트 용액을 5ml 씩 더한다.
3. Vortex mixer를 이용하여 용액을 섞어준다.
4. 모든 시험관을 물 중탕(70-80℃)에 넣고 20분간 중탕한다.
5. 각 시험관의 시료의 색과 침전물 생성 여부를 관찰하고 기록한다.
당의 분석
Results
Glucose, Fructose, Sucrose, 전분용액, 베네딕트 용액, 증류
수, 시험관, vortex mixer, hot plate, pipet, tip
변하는 순서
Glucose
Fructose
Sucrose
전분 용액
색깔
침전물 유무
환원당 여부