2장. 임상미생물의 진단검사

1. 현미경의 종류와 사용목적에 대하여 설명한다. (명시야, 형광, 암시야, 위상차현미경) 2. 명시야 현미경의 구조에 대하여 설명한다.

현미경의 단위

• • • 미생물의 형태와 크기 측정 미세자 이용; 접안 미세자, 대물 미세자 단위 ; 1m기준 – 1 cm = 10 -2 m – – – – – – – 1 ㎜ = 10 -3 1 ㎛ = 10 -6 1 A = 10 -8 1 ㎚= 10 -9 m m m m 1 pm(picometer) = 10 -12 1 fm(femtometer) = 10 -15 m m 1 am(attometer) = 10 -18 m

현미경의 정의

• 사람의 눈으로 관찰이 불가능한 미세한 물질을 알맞은 렌즈와 적당한 빛을 이용하여, 표본 (검체)을 자신이 원 하는 크기로 확대시켜, 관찰할 수 있게 하는 장비로서, 보 통 현미경이라 하면 광학현미경을 가리킴.

현미경의 원리

• 복합 현미경(compound microscopy)의 원리는 • 일단 대물렌즈에 의해 검체의 중간상 (intermediate image)이 만들어지고 • 다시 이 중간상을 대안렌즈로 확대해서 보는 것이 다.

현미경의 구조와 원리

세균의 형태

현미경의 종류

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1. 광학 현미경

미생물, 동식물의 세포, 약학 연구에 쓰이는 현미경으로서 주로 미생물, 세포 등의 배 양 상태를 관찰 병원에서도 가장 많이 사용.

해상력 : 두 개의 떨어진 점을 구별할 수 있는 능력 즉 분별 한계 미생물을 관찰하기 위한 일반적인 배율 = 500 - 1,000 × 대물렌즈 100 × 접안렌즈 10 × 유침유: 유리와 굴절율이 동일 --> 시야가 더 밝음.

현미경의 종류

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2. 암시야 현미경(Dark field microscope)

주로 미립자나 혈액속의 지방 입자를 관찰 어두운 방에 빛이 들면 먼 지가 빛나 보이는 현상을 볼 수 있 는데 후방의 배경이 되는 빛이 입자에 닿으면 빛이 산란되면 서 미립자의 위치, 형태, 크기를 알 수 있게 됨.

Dark field ring을 condenser에 끼워 빛이 경사지 게 들어오게 함으로서, 배경이 어둡고, 사물은 밝게 보이도록 하여 나선균 과 같이 가 늘고 배양이 어려운 미생물을 관찰.

암시야 집광 렌즈 를 이용.

스피로헤타, 렙토스피자 같은 투명한 세균체의 윤곽 관찰.

암시야 현미경의 원리

현미경의 종류

3 . 위상차 현미경 • 투과광의 위상차를 명암의 차이로 바꾸는 것으 로 살아있는 세포의 내부 구조를 직접 관 찰

현미경의 종류

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4.

형광현미경(Fluorescent microscope)

파장이 짧은 자외선을 시료에 비추면 형광을 발하는 원리를 이용하 여, 시료에 형광물 질(형광색소)을 처리한 후 관찰하는 방법으로 병 원에서 면역검사에 많이 이용되고 있 다. (특정 flurochrome에 염색 된 사물이나 면역 형광물질을 excitation filter를 통과한 일정파장의 빛에 노출시킨 후 발생된 형광을 관찰) 형광 이소티오시안산염 (FITC) 는 UV를 쪼이면 0.2 μm 보다 긴 파장 인 형광을 발하는 유 기화합물을 이용 ; 조직학, 병리학, 면역학 등.

형광현미경

형광색소와 면역형광 염색의 원리

현미경의 종류 5. 전자 현미경(Electron microscope)

빛 대신에 전자선을 사용하여 초극미의 세계까지 관찰 이 가능하다. • - 전자현미경은 전자파를 만드는 부분과, 시료를 충돌시켜 반사 투과 한 전자파를 모으는 부분으로 되어 있다. - 전자렌즈의 분해능은 0.2㎚로 높고 배율도 수만에서 수십만 배가 된 다. • - 최근에 는 입체관찰이 가능한 주사 전자현미경이 개발되어 세포, 조 직뿐만 아니라 염색체의 입체구조 연구에도 이용되고 있다.

전자 광선으로 물체형태 관찰 TEM(전달 EM), SBM(스캐닝 EM); 100 × - 10,000,000 ×

염색

• 미생물 염색에 사용되는 염료

1)산 염료

색소체가 음이온(-)으로 전이 ex. 에오신 염료---> 용액 ---> 나트륨 + 에오신(-) 음이온 발색단은 미생물 세포속의 염기성 기본성분에 결합 •

2)염기 염료

색소체가 (-) 양이온(+)으로 전이 ex. 메틸렌 블루---> 용액 ---> 메틸렌 블루(+) + 염화물 양이온 발색단은 미생물 세포속의 산성 기본성분과 결 합

도말표본 준비와 염색

- 미생물은 무색투명하므로 미생물의 형태 와 특정구조를 알기 위해서는 염색 (staining) 과정이 필요.

- 도말표본제작의 단계: 도말(smear) → 건조(dry) → 고정(fixation) → 염색(staining) → 수세(washing) → 건 조(dry) → 검경(microscopy finding)

검체 도말

감별염색

두 가지 이상의 염료가 쓰이므로, 세균의 종류나 그 구조 에 따라, 서로 다른 색으로 염색.

1) 그람염색(Gram stain)

- 그람양성균은 세포벽에 있는 두꺼운 peptidoglycan 층에 의해, 매염작용제를 사용시 알코올에 의해 탈색되지 않는 특징. ① 1차 염색시약(the Primary Stain) Crystal Violet ② 매염제(the Mordant) Iodine Solution ③ 탈색제(the decolorizer) Alcohol ④ 2차 염색시약(the Counter stain) Safranin

특징

그람양성세균과 그람음성세균의 특징 비교

그람 양성 그람 음성

세포벽 구성 항생제 감수성 덜 복잡하고 mucopolysaccharides 와 mucopeptides로 되어있다.; 지방은 거의 없다.

감수성이 많다 더 복잡하다; mucopeptide 로 이 루어져 있고 한 쪽은 지방, 다당류 나 다른 단백질로 이루어져있다.; 지방이 많다.

감수성이 적다 음파 저항성 저항이 크다 저항이 작다 리조좀 저항성 염료 억제 아포 형성 독소 형성 저항이 작다 크리스탈 바이올렛으로 저해된다.

몇몇 간균은 아포를 형성한다.

생산되는 독소는 주로 외독소이다.

저항이 크다 크라스탈 바이올렛으로 저해되지 않는다.

아포를 형성하는 간균은 업 없다.

생상되는 독소는 주로 내독소이다.

감별염색

2) 항산성염색(Acid-Fast stain)

- 결핵균과 나병균은 세포벽에 지질과 왁스성 분의 물질을 갖고 있어, 염색이 잘 안되지만, 일단 염색이 되면 산에 탈색이 안되는 항산성 의 특징. - 산과 알코올에 저항 ① 1차 염색시약(Primary Stain): carbolfuchsin ② 탈색제(Decolorizer): acid-alcohol ③ 2차 염색시약(Counter stain): methylene blue

특수염색

- 미생물이 가지고 있는 특정 구조인 협막, 편 모, 아포 등을 확인 할 때에 사용한다.

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1) 협막염색(Capsule stain)

- 미생물 세포벽의 외층에 있는 협막(capsule) 은 젤라틴성 물질이나 점질층으로 둘러싸 여 있어, 일반염색으로 관찰이 곤란하여, 특수염 료를 사용.

- 폐렴구균이 대표적으로 많이 사용되며, 염색 법으로는 Antony's method 등.

Möller's method와 Nilgrosin method, Duguid 방법, Hiss 방법 등.

특수염색

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2) 아포염색(Endospore stain)

- 아포는 불리한 외부환경에서 미생물을 보호 해주는 역할을 하며, 일반염색으로 관찰이 곤 란하여, 특수염료를 사용. 아포는 보통 염색법 으로 잘 염색되지 않는다.

Möller's methods: 아포-적색, 세포질-청색 Dorner's methods: 아포-적색, 배경-검은색 파상풍균, 탄저균, 가스괴저균 등의 검출방법

특수염색

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3) 편모염색(Flagella stain)

- 편모는 세균의 운동성을 나타내는 구조이며, 가늘 고 길기 때문에, 일반염색으로 관찰 이 곤란하여, 특수염료를 사용한다.

Koch가 오래전에 편모염색법을 고안, 편모는 직경 이 10-30nm, 일반적으로 운동성이 없는 세균은 편 모가 없다.

Nishizawaa-Kasahara's methods Gasares -Gil's method Gray method Leifson method 장티프스균, 이질균, 콜레라균 등의 검출방법

특수염색

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4) Metachromatic granules staining

diphtheria균(Corynebacterium diphtheriae)의 이염색소체(matachromatic granules)를 염색하는 방법, 균체의 양단에 각기 염색성을 달리하는 과립이 존재.

Albert-Christensin modification 방법

특수염색

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5) Richettsi, Chlamydia, virus 의 inclusion body(봉입체) 및 elementary bodies(기 본 소체) 염색법

Macchiavello's 염색 Wright's 염색 Giemsa 염색 Mann's 염색 Paschen's 염색