Transcript Preparation, characterization and in vitro release of chitosan

Preparation, characterization and in vitro
release of chitosan nanoparticles
loaded with gentamicin and salicylic acid
충북대학교 식품공학과 조윤원, 이은숙
Contents
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1. Materials
2.2. Preparation of compound CS nanoparticles
2.3. Characterization of GM/SA compound CS nanoparticles
2.4. Determination of drugs loading capacity of nanoparticles
2.5. In vitro release studies
3. Results and discussion
3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA
3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles
3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles
4. Conclusion
Introduction
 Gentamicin(GM)
 Aminoglycoside계 항생제
 Micromonospora purprea 및 Micromo echinospora가 생산하는 아




미노 배당체계의 항생물질
겐타마이신 C1, C2, C1a의 혼합물
특히 Gram(-)균에 효과적
Side effects- 청각상실(ototoxicity), 신장손상(nephrotoxicity)
예방법- glutathione, salicylic acid, aspirin이 free radical을 소거하여
GM의 ototoxity를 예방
Introduction
 GM과 SA의 Separating injection의 단점
 GM 1/1day, SA 2/1day => 환자들이 불편
Free radical이 발생하면 높은 activity로 인해 주변 macromolecule
와 반응
 GM의 Free radical의 ototoxicity를 효과적으로 억제하기 위해서는
scavenger는 Free radical이 생성되자마자 반응할 수 있어야 함.
 따라서 Separating injectiond은 체내에서 GM과 SA의 미미한 조절
을 야기하고 결과적으로 SA의 길항작용을 줄여줌.

Introduction
 Nanoencapsulation의 이점
 특정 사이트에 작용하는 것과 약리성분 방출의 조절과 같은 적절
한 delivery system은 약의 생체이용률을 개선하고 부작용을 최소
화 할 수 있음.
 NPs 는 약효의 상실로부터 약물을 보호하고 캡슐화되거나 흡수된
약물의 방출을 제어함.
 의약품의 nanoencapsulation은 선택된 조직에서의 흡수의 강화와
세포내 침투 ,이용률, 유지시간을 개선하여 약물사용의 비용과 독
성의 위험을 줄 일수 있음.
Introduction
 Chitosan
 CS, PGLA, PLA는 NPs의 합성에 이용됨.
 CS는 자연발생적이고 다량으로 이용할 수 있는 polysaccharide로 chitin








의 N-deacetylation product임.
CS의 상대분자량은 수천수백에서 수백만임.
CS와 유도체-제약과 의약에 널리 사용
좋은 생물학적 특성(biocompatibility, biodegradability, antibacterial
activity)
빠른 치유(fungistatic, anticancerogen, anticholesteremic)
낮은 독성(LD50=16g/kg, 소금,설탕과 비슷)
CS의 유도체는 좋은 항 산화력을 가짐. =>CS의 NPs는 약물과 유전자
전달에 사용 적합.
CS는 amino group때문에 산성조건에서 양성화되고, TPP와 같은 음이
온으로 교차 결합할 수 있음.
교차연결을 통하여 CS NPs 준비가 단순하고 유연함.
Introduction
 현재 연구에서 복합CSNPs는 이온결합법에 의해 합성됨.
 GM과 SA는 NPs에 로드 됨.
 복합 NPs은 동시에 GM과 SA를 방출 할 수 있었고, 따라서 SA의 길
항작용이 강화되었음.
 CSNPs의 물리화학적 특성은 TEM, SEM, XRD FT-IR과 같은 다양한
분석 기법을 이용하여 조사 되었고, 체내에서 약물 방출능 또한 조
사되었다.
Materials and methods
 2.1. Materials
 CS(chitosan 95%, MW: 80KDa)
 GM(gentamicin)
 SA(salicylic acid)
 TPP(Tripolyphosphate)
 기타 모든 재료는 analytical grade 사용
Materials and methods
 2.2. Preparation of compound CS nanoparticles
 CSNPs 는 TPP에 CS가 이온가교 결합함을 기초로 하여 준비됨.






0.2% CS(in 1% acetic acid) at room temperature with sonication
pH4.0~5.5의 다양한 pH의 CS solution 와 일정한 Volume의 GM과
SA solution을 혼합 (GM:SA,1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5)
CSNPs는 TPP 용액이 dropwise 에 의해 혼합액에 첨가되었을 때 자
발적으로 형성.
선택된 질량비율 CS:TPP , 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1
NP 현탁액은 1시간 동안 지속적으로 교반하고, 30분 동안
16,000rpm에서 원심분리함.
만들어진 NPs는 동결건조및 저장됨.
Materials and methods
 2.3. Characterization of GM/SA compound CS nanoparticles
 2.2에서 얻은 NPs의 입자크기, zeta potential과 PDI는 photon






correlation spectroscopy using nano ZS90 Zetasizer에 의해 측정.
Sample은 적절한 농도의 탈이온수와 함께 준비
CSNPs을 실은 약물의 표면형태는 TEM, SEM으로 관찰
TEM- NPs solution 을 phosphotungstic acid에 의해 천연적으로 염
색된 구리격자에 떨어뜨렸고, 실온에서 건조
SEM- NP 현탁액을 유리판에 분사하고 실온에서 건조. 건조된
NPs는 진공하에서 금으로 코팅되면 검사
FT-IR - CS,GM, SA, drug-loaded NPs의 화학구조와 복잡한 형성은
FT-IR로분석 하였다. Sample은 KBr과 건조 표본을 분쇄하고 디스
크을 형성하기 위해 혼합분말을 누르는 것에 의해 준비
XRD- X-ray diffractometer를 사용하여 수행. 5도~40도까지 스캔
Materials and methods
 2.4. Determination of drugs loading capacity of
nanoparticles
 GM은 deoxystreptamine, purpurosamine and garamine으로 구성
 자외선 영역에서 특정한 흡수가 없음
 GM은 산성조건이나 PBS내에서 aglycone and sugar를 양적으로
가수분해
 가수분해는 248nm에서 UV spectrophotometry로 분석
 SA는 297nm 에서 UV spectrophotometry로 분석. 248nm에서 SA
의 UV 흡수가 약하기 때문에 GM의 양을 계산하기 위하여 다른
분광광도법을 사용.
 NPs의 encapsulation efficiency (EE)와 loading capacity (LC)는 이
전의 연구에서 설명된 방법에 따라 결정
Materials and methods
 2.4. Determination of drugs loading capacity of nanoparticles
 drug-loaded NPs(20mg) 을 상온 24시간 동안 5ml의 0.1mol HCl로
추출하였고, NPs현탄액을 16000rpm에서 30분 동안 원심분리하
였음. 상등액의 GM과 SA는 각각 248nm와 297nm에서 측정.
 Blank Sample 은 loaded drugs 없는 NPs로부터 만들어졌고, drugloaded NPs와 동일하게 처리됨.
 모든 Sample은 3회 측정됨.
 EE(encapsulation efficiency)와 LC(loading capacity) 계산식
F: 상등액에서 GM or SA의 free 양
T: GM or SA의 총량
W: NPs의 무게
Materials and methods
 2.5. In vitro release studies
 vitro release는 PBS(pH 7.4)에서 수행.
 GM/SA loaded CSNPs(30mg)와 5ml의 PBS를 투석 튜브로 옮기고,
투석튜브를 37도씨 50ml PBS에 넣고 100 stocks/min.로 교반.
 특정 시간 간격으로 매체는 fresh PBS로 교체해줌.
 세 Sample은 각 시점에 분석.
 PBS내로 방출된 GM과 SA의 농도 UV 분광광도법으로 결정
Results and discussion
 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA
 0.1% SA : 0.2%GM = 1.5 : 1,
CSsolution pH=5.0
 CS/TPP mass ratio 증가-> EE, LC감소, size 감소.
입자표면의 charge 강화

positive zeta potential -> amine group에 의함.
Results and discussion
 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA
pH 증가 -> zeta potential 감소 , CS의 +charge감소와 연관.
particle size 증가 , particle 응집
pH 4.0에서 SA의 LC값이 높음->용액의 pH가 SA의 pKa에 가깝고,
낮은 PH가 CS의 양성화를 강화시킴
pH 5.0에서 GM의 LC값이 높음->TPP의 음이온과 CS의 +charge관련
cross-link reaction을 강화
Results and discussion
 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA
 drug-to-polymer ratio 감소-> EE증가, 입자크기 감소,
zeta potential 증가,
 높은 zeta potential은 입자의 응집형성방지
 drug-to-polymer ratio 1:4 ->LC가 높음
Results and discussion
 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA
SA비율 증가-> SA의 EE 감소
LC 증가
GM의 LC와 EE는
반대 경향
Results and discussion
 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles
Results and discussion
 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles
GM/SA가 CS nanoparticles에 성공
적으로 load됨.
CS (A)
SA/GM-loaded CS nanoparticles (B) gentamicin (C)
and salicylic acid (D)
Results and discussion
 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles
SA/GM-loaded CSNPs는 peak는 유지하나,
강도는 감소
18, 24 에서의 새로운 peak 발생.
ionic interaction에 의해 유도
SA (A)
CS (B)
GM (C)
SA/GM-loaded CS nanoparticles(D)
Results and discussion
 3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles
First phase : 4시간 동안, 45% 의SA, 38%의GM이 방출,
급속한 방출과정은 초기에 NPs 표면의 약품이 쉽게 확산.
Second phase : 4-12시간, 약물이 매트릭스에서 확산, 87% SA, 81% GM 방출
Third phase : polymer degradation.으로 더 느린방출과정,
녹은 약물이 방출 매제로 확산, 72시간 동안 95% SA, 92% GM
방출
Results and discussion
 3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles
Conclusion
 GM/SA loaded CSNPs TPP의 가교결합에 의해 성공적으로 준비됨.
 NPs는 안정하고, 좁은 크기분포를 가진 구형임.
 GM and SA의 entrapment efficiency 와 loading efficiency 는GM and
SA the mass ratio of CS to TPP, the drug to polymer ratio, the pH of
CS solution, the feed ratio of SA to GM로 얻을 수 있었다.
 체외방출 연구는 SA와 GM의 비율이 GM과 SA의 방출 속도에 영
향을 준다는 것을 나타내었다.
 CSNPs에서 SA와 GM의 방출량은 SA/GM loaded CSNPs는 GM의
이독성 길항작용에 효과가 있다는 것을 제안하였다.
감사합니다.