Transcript Functional Gene Analysis

Molecular Biological Tools in the
Environmental Engineering
The value of applying molecular
biological tools in environmental
engineering
Soil Quality Laboratory
2009. 1. 13.
What are values of MBTs in EE?
To develop a fundamental understanding of
microbial communities in order to optimize
process
To replace existing culture-based screening
technique for microorganisms (e.g. coliform
testing of portable water)
in case of bioremediation, MNA
(Monitored Natural Attenuation),
biological wastewater treatment,
anaerobic digestion, and so on.
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미생물을 이용한 정화기술의 발전
토착미생물에 의한 자정작용
(Intrinsic bioremediation)
Bioavailability,
Mass transfer
순수분리균 이용한 현장 정화,
Superbug 이용한 반응조 정화
(Bio-manipulation)
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Back to microbial ecology
• consortium의 중요성
• 타 미생물과의 상호작용
• 미생물-오염물질-토양 상호작용
-> 토착미생물 분해능 향상 도모
(Engineered bioremediation)
MBTs in EE - Example
From EPA Research Highlights
Examples of bioremediation and MNA
1. 특정 물질을 분해할 수 있는 미생물이 해당 site에 존재하는가?
(계통학적 분석 – phylogenetical analysis)
2. 해당 site의 미생물들이 특정 물질을 분해하는 효소를 만드는가?
(기능 분석 – functional gene analysis)
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Objectives for this presentation
1. 특정 미생물이 있는지, 그 분율은 얼마인지 알아내는
기술
2. 실제 오염물질을 분해하는 효소가 생산되는지, 그 조
건은 어떤 것인지 알아내는 기술
위와 같은 분자생물학적 기술들을 환경공학에서 어
떻게 적용하고 있는가?
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개념 정리
1. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid)
 생물체가 살아가기 위한 유전정보를 담
고 있는 매체, 다음 세대로 ‘유전’됨
 Cytoplasm 내에 꼬인 상태로
존재하거나 (chromosomal DNA)
ribosome, mitochondria에 독립적으로
존재
< Prokaryotic cell structure>
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개념 정리
5’
3’
A G C T A G C T G A G A G C T
풀어서 보면
T C G A T C G A C T C T C G A
3’
5’
 Adenine, guanine, cytosine, thymine의 4 가지
base의 서열로 유전정보 결정됨
 A = T : 이중결합
G ≡ C : 삼중결합
 Base는 서로 상보적 (complementary) 결합
 bp: DNA의 길이 단위
< Double-helical DNA>
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개념 정리
DNA
RNA
Transcription
Protein
Translation
3개의 base가 하나의 amino acid 생성 (alanine- phenylalanine-arginine-..)
Amino acid sequence → protein (enzyme; dioxygenase, monooxygenase..)
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개념 정리
2. 16S rRNA gene in Molecular systematics
Ribosome
50S
mRNA
Transcription
C U G
T C G A T C G A C T C T C G A
30S
5’
3’
16S
•
Ribosome으로 tRNA가 전사된 RNA 사슬을 운반하여 ribosome 내에서 translation
•
Ribosome의 구성 성분을 이루고 있는 것이 ribosomal RNA
•
모든 bacteria가 가지고 있다
•
중요한 기능을 수행하기 때문에 진화적으로 잘 보존된 부분 → 이 부분의 염기서열
분석으로 계통학적 분류 가능
•
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약 1600 bp 정도의 크기
개념 정리
The secondary structure of 16S rRNA gene
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개념 정리
3. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Primer
PCR
<원하는 부분만 DNA 증폭>
DNA의 양을 늘리는 반응
- duplication 반복, 대수적 증가
- Taq polymerase 사용
DNA 중 원하는 부분만을 증폭 가능
- primer
DNA의 melting temperature
= anealing temperature 의 원리를 이용함
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Microbial Community Dynamics
From EPA Research Highlights
1. 특정 물질을 분해할 수 있는 미생물이 해당 site에 존재하는가?
존재한다면, 전체 미생물 군집 중 비율은 얼마나 되는가?
2. (PRB의 경우) 설치 전, 후, 설치 지점에서의 미생물 군집 변화는
어떠한가?
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Microbial Community Dynamics
1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
- DNA의 G+C %에 따라 band 분리됨
: 즉 각 band는 다른 bacteria 나타냄
- Microbial community의 pattern 분석에 사용
< Comparative DGGE band profiles of the denitrification consortium and some
cloned samples >
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Microbial Community Dynamics
2. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism)
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Microbial Community Dynamics
3. PLFA analysis (PhosphoLipid Fatty Acid analysis)
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Microbial Community Dynamics
4. FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
- Each FISH probes labelled
with different fluorescent
dyes have been used to
simultaneously identify the
structure of microbial
community
<Three-color fluorescent in situ hybridization image of bacteria>
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Microbial Community Dynamics
5. Clone Library
PCR
Extracted
DNA
16S rDNA
Ligation
transformation
Plasmid에 sample DNA 집어넣음
E. coli 사용, 각 cell마다
plasmid가 하나씩 들어감
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Microbial Community Dynamics
Culture
각 colony 로 분리
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각자 배양하여 sequencing
Microbial Community Dynamics
6. SIP (Stable Isotope Probing)
C 13- labeled
substrate
serum vial
soil sample
SIP
(Stable Isotope Probing)
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Functional Gene Analysis
From EPA Research Highlights
1. 해당 site에서 실제 효소의 활성 정도가 측정되는가?
2. 오염 물질 분해/처리 정도에 따라 효소의 활성이 변하는가? 그
것을 정량적으로 측정할 수 있는가?
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Functional Gene Analysis
1. Real-time PCR
- 이제까지의 endpoint analysis에 기초한 PCR 법은 DNA의 분율을 정확
히 나타내지 못함
- 그러므로 초기 DNA의 각 분율당 양을 정확히 알아내는 기법 필요
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Functional Gene Analysis
- 매 cycle 마다 증가하는 DNA의 양을 측정
- 전체 DNA 중 target DNA의 증가량을 측정할 수 있음
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Functional Gene Analysis
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Functional Gene Analysis
2. Microarray
• A technique for determination of the
expression patterns of specific genes
• Employing "chip technology" where
tens of thousands of DNA or protein
molecules are arrayed
• High-throughput method
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Functional Gene Analysis
3. Dot blotting
Slot-Blot Analysis를 이용한 TPH-degrading gene의 활성 측정
Probes
Samples
30 ng
20 ng
농도별
standard
10 ng
slot-blot analysis 장치
25
5 ng
Probe
Compounds
targeted
Target gene
alkB
alkane
Alkane hydroxylase
(alkane 1-monooxygenase)
nahA
naphthalene
Naphthalene dixoygenase
nahH
catechol
Catechol 2,3-dioxygenase
todC
BTEX
Toluene dioxygenase
xylA
toluene, xylene
Xylene monooxygenase
각 spot의 image 분석을
통해 calibration curve를
작성하여 sample에서의 각
효소 유전자 농도 측정 가
능
(Stapleton and Sayler, 2000년)
현장실증실험에서 유류분해와 분해관
련
유전자 활성 간의 상관관계 보고
Functional Gene Analysis
4. Biosensor
Promoter
오염물질에 의해
induction되는 promoter
Reporter gene
Lux, gfp, lacZ
- 다양한 매체에서 오염물질의 농도 측정
가능
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Functional Gene Analysis
5. Metagenome
Soil
plate
cultivation
1,000 novel
genes
10 novel genes
lysis
Mechanical agitation
- clones
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Functional Gene Analysis
6. RNA Work
RNA (A, U, G, C로 이루어져 있음) extraction 후 역전사 (reverse transcription) 시켜
cDNA로 만든 후에 실험
DNA
RNA
Transcription
Protein
Translation
DNA work: 어떤 일이 일어날 것이라는 ‘potential’ 을 알 수 있음
RNA work: 실제 어떤 일이 일어날 것이라는 예측 가능
Protein work: 실제 어떤 일이 일어나고 있다는 증명 가능
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Functional Gene Analysis
7. Proteomics
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Functional Gene Analysis
처리 전후의 단백질 발현 정도 차이 분석 (2-D Gel analysis)
pI
MW
<before treatment>
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<after treatment>
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