Transcript Diseño de bacterias para inmobilización de metales: Bio-remediación de suelos

Diseño de bacterias para
inmobilización de metales:
Bio-remediación de suelos
Marc Valls y Víctor de Lorenzo
Abundancia
Ca, Mg, Fe
Mn, Cu, Co, Zn
Pb, Cd, Ni, Ag, Hg
Toxicidad
Mecanismos de toxicidad de
los metales pesados
- Alteración de las funciones de los metales esenciales.
- Interferencia en la homeóstasis del Ca.
- Permeabilización de membranas.
- Efectos sobre la estructura del DNA.
Río Guadiamar el día después del accidente de Aznalcóllar
Bacterias para la
bioremediación
de metales pesados?
METALES
NANO
1
10
MICRO
100
1
ORGANISMOS
Metalotioneínas
Eucariotas
Cianobacterias
10
MILI
100
1
10
MOLAR
100
1
10
Metalotioneína-2 de rata
1- Mouse
MDPNCSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKGAADKCTCCA
2- Snail
SGKGKGEKCTSACRSEPCQCGSKCQCGEGCTCAACKTCNCTSDGCKCGKECTGPDSCKCGSSCSCK
3- Crab
MPGPCCNDKCVCQEGGCKAGCQCTSCRCSPCQKCTSGCKCATKEECSKTCTKPCSCCPK
4- Sea urchin
MPDVKCVCCKEGKECACFGQDCCKTGECCKDGTCCGICTNAACKCANGCKCGSGCSCTEGNCAC
5- Drosophila
MPCPCGSGCKCASQATKGSCNCGSDCKCGGDKKSACGCSE
6- C. elegans
7- Tetrahymena
8- Neurospora
9- Candida
VCKCDCKNQNCSCNTGTKDCDCSDAKCCEQYCCPTASEKKCCKSGCAGGCKCANCECAQAAH
KVNNNCCCGENAKPCCTDPNSGCCCVSETNNCCKSDKKECCTGTGEGCKCTGCKCCQPAKSGCCCGDKAKACCTDPNSG
CCCSSKTNKCCDSTNKTECKTCECCK
GDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK
ANDCKCPNGCSCPNCANGGCQCGDKCECKKQSCHGCGEQCKCGSHGSSCHGSCGCGDKCECK
10- Candida
PEQVNCQYDCHCSNCACENTCNCCAKPACACTNSASNECSCQTCKCQTCKC
11- Yarrowia
MEFTTAMFGTSLIFTTSTQSKHNLVNNCCCSSSTSESSMPASCACTKCGCKTCKC
12- Saccharomyces
MFSELINFQNEGHECQCQCGSCKNNEQCQKSCSCPTGCNSDDKCPCGNKSEETKKSCCSGK
13- Saccharomyces
MTVKICDCEGECCKDSCHCGSTCLPSCSGGEKCKCDHSTGSPQCKSCGEKCKCETTCTCEKSKCNCEKC
14- Cianobacteria
15- Pea
TSTTLVKCACEPCLCNVDPSKAIDRNGLYYCSEACADGHTGGSKGCGHTGCNCHG
MSGCGCGSSCNCGDSCKCNKRSSGLSYSEMETTETVILGVGPAKIQFEGAEMSAASEDGGCKCGDNCTCDPCNCK
MT
Alb.
CdAlb.
Cd2+
MT
Cd2+
CdMT
CdMT
CdMT
Cd2+
Hígado
Intestino,
pulmones
Riñón
CdMT
METALES
NANO
1
10
MICRO
100
1
10
MILI
100
1
10
MOLAR
100
1
10
Exportación, reducción
ORGANISMOS
Metalotioneínas
Gram-positivas
Eucariotas
Cianobacterias
Gram-negativas Quimiolitótrofos
E. coli Alcaligenes sp.
Sistemas de expresión
de metalotioneínas en
la superficie de E. coli
Envuelta de gram-negativas
Membrana externa
Espacio periplásmico
Peptidoglicano
Membrana interna
1.
OM
2.
OM
3.
1. Lpp-OmpA-MT
2. LamB-MT
3. MT-IgAb
4. MT-PAL
4.
OM
Peptidoglicano
IgA proteasa de Neisseria
ME
Periplasma
MI
Citoplasma
Plac
Leader
MT
E-Tag
IgA
M2+
medio
Periplasma
C
Fraccionamiento de E. coli pMt
Soluble
KDa
200
97.4
66.2
45.0
31.0
wt Dsba-
MI
wt Dsba-
ME
wt Dsba-
Localización de MT-IgAen E. coli
Soluble
KDa
200
97.4
66.2
45.0
31.0
wt Dsba-
MI
wt Dsba-
ME
wt Dsba-
ELISA sobre células
1
2
Intacta
Choque osmótico
Superficie
Superficie + periplasma
3
Lisada
Proteína total
3
Exposición en
la superficie
2
DO492
1
1- Superficie
2- Superficie + periplasma
3- Proteína total
0
pMt
Estirpe
WT
+
+
WT
Dsba-
15
10
Bioacumulación
de Cd2+ en E.
coli
nmoles
Cd2+/mg
5
0
pMt
Estirpe
-
+ +
WT WT Dsba-
Problemas
Soluciones
- Las cepas de laboratorio - Usar estirpes del suelo.
son inadecuadas.
- E. coli es sensible a los
metales.
- Usar bacterias resistentes
a metales.
- Se requiere selección
para mantener los genes
- Integrar los genes en el
cromosoma.
- Inducción con IPTG
- Inducir con aromáticos.
Expresión de
metalotioneínas en
bacterias del suelo
(Ralstonia eutropha)
Estructura del transposón Tn5-MT
Km
I
XylS
Pm
MT
O
1 Kb
Transposición de TnMT
Escherichia coli
Ralstonia sp.
Pseudomonas sp.
Transposición de TnMT
Ralstonia sp.
Pseudomonas sp.
Expresión de MT-IgA en R. eutropha
-
TnMT
3-MB
KDa
66.2
55.0
42.7
40.0
30.1
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
Localización de MT-IgA en R. eutropha
TnMT
KDa
97.4
66.2
55.0
42.7
40.0
+
+
-
Sol. MI ME
Sol. MI ME
Sol. MI ME
300 M
E. coli
R. eutropha
45
30 M
30
30
30
nmoles 15
Cd2+/mg
15
15
0
0
0
MT
-
+
-
+
-
+
Ralstonia eutropha MT
Nice but…
does
it work in
polluted
soil?
Inmobilización de Cd2+ en el suelo
1
Suelo estéril
2
+Ralstonia wt
3
+Ralstonia MT
1
Suelo estéril
2
+Ralstonia wt
3
+Ralstonia MT
Efecto de
R. eutropha
sobre el
crecimiento
vegetal
15
3
2,5
2
1,5
1
Peso seco (g)
0,5
Clorofila (mg/g)
0
Estéril WT
MT
+Cd2+ +Cd2+ +Cd2+
Control
(sin Cd2+)
Inmobilización de
Cd2+
en suelo
1- Suelo estéril
2- + Ralstonia wt
3- + Ralstonia MT
1
2
3