Transcript CDKs y Ciclinas Y. Acosta, N. Akizu, E. Castellanos,

CDKs y Ciclinas
Y. Acosta, N. Akizu, E. Castellanos,
A. Corrionero y M. Ruiz
Introducción
CDKs y ciclinas
• CDKs (Cyclin-Dependent Kinases)
– Ser/Thr Kinasas
• Fosforilación de histonas, proteínas
del citoesqueleto, APC, pRB...
– 33-40 kDa
– CDK1-4 y CDK6
– Regulación:
• Ciclinas
• Fosforilación
• Inhibidores (CKIs)
REGULACIÓN
CICLO
CELULAR
Introducción
• Ciclinas
–
–
–
–
Reguladoras actividad de CDK
Concentraciones variables a lo largo del ciclo
Ciclinas A, B, D, E
Degradadas por ubiquitinación
Introducción
Ciclo celular
• Se divide en 4 fases:
– Fase G1: preparación para la
duplicación del DNA; aumento
del tamaño y síntesis de
proteínas.
– Fase S: se produce la
duplicación del DNA.
– Fase G2: comprobación de la
correcta replicación del DNA.
– Fase M: condensación del DNA
en cromosomas y separación de
las cromátidas dando lugar a los
dos núcleos de las células hijas.
Citocinesis.
Ciclo celular
FASE
COMPLEJO
G1
Cdk4,6/ciclinaD
Cdk2/ciclinaE
S
Cdk2/ciclinaA
G2/M
Cdk1/ciclinaB
M
Cdk1/ciclinaB
CDKs
CDKs
Clasificación
•
•
•
•
•
Clase: α + β
Plegamiento: Protein Kinase-like
Superfamilia: Protein Kinase-like
Familia: Protein Kinase, catalytic subunit
Subfamilia: Serine/Threonin Kinases
CDKs
Regulación
CDK
Inactiva
INK4
Inhibidores
Ciclina
CDK-Ciclina
Parcialmente activa
Cip
Inhibidores
Fosforilación
inhibitoria
CAK
Ciclina-CDK- P
Totalmente activa
CDKs
Estructura
• Región N-terminal (N-lobe): láminas β
– PSTAIRE
• Región C-terminal (C-lobe): hélices α
• Región central:
– Centro catalítico
– Unión ATP
– T-loop
N-lobe
CDK2
PSTAIRE
90º
N-lobe
PSTAIRE
T-loop
T-loop
C-lobe
C-lobe
CDKs
CDK2-CDK6
PSTAIRE
N-lobe
Thr160
PSTAIRE
T-loop
Thr160
Thr153
Thr153
T-loop
CDK2
C-lobe
RMSD = 1.25
CDK6
CDKs
CDK2-CDK5
N-lobe
CDK2
CDK5
PSTAIRE
T-loop
PSTAIRE
Thr160
Ser159
C-lobe
RMSD = 1.25
T-loop
CDKs
CDK2:
T-loop
PSTAIRE
Ciclina A
Sustrato
ATP
Mg
CDK2-CiclinaA
Ciclinas
Ciclinas
Clasificación
•
•
•
•
Clase: All α-proteins
Plegamiento: Cyclin-like
Superfamilia: Cyclin-like
Familia: Cyclin
Ciclinas
Estructura
• 12 hélices α en dos dominios (90 aa) con
idéntico plegamiento:
– Caja ciclina (hélices α1- α5) Right handed
• hélice α3: núcleo hidrofóbico
– Hélices α1’- α5’
• Caja de ubiquitinación (9 aa en
N-terminal)
3 helix bundle
+ 2 α hélices
Ciclinas
Estructura
Caja ciclina
α4
α C-terminal
α1
α3
α2’
α5’
α3’
α2
α5
α1’
α N-terminal
α4’
Ciclinas
Superposición de dominios:
3 helix-bundle + 2 hélices α
α5
α4
α3
α2
α1
RMSD = 2.50
CDKs
CiclinaA-CiclinaH
α4’
a
α2
α5
α1’
α3’
α3
α4
α2’
α1
RMSD = 2.50
α5’
CDKs
CiclinaA-Ciclina Viral
Caja ciclina
α5’
α1
α4
α3’
α3
α2’
α2
α5
α1’
α4’
RMSD = 2.50
CDK2-CiclinaA
Superposición CDK2
CDK2
CDK2/CiclinaA
CDK2-P/CiclinaA
T-loop
PSTAIRE
RMSD=1.49
Superposición CDK2
CDK2/ciclinaA
CDK2-CDK2/ciclina
CDK2
PSTAIRE
Thr160
T-loop
Thr160
CDK2/ciclinaA
(T-loop)
Giro reverso
Hojas β
RMSD=1.39
CDK2
(T-loop)
Hélice αL12
Superposición CDK2
CDK2/ciclinaA -CDK2-P/ciclinaA
CDK2/CiclinaA
PSTAIRE
T-loop
CDK2-P/CiclinaA
RMSD=0.80
Interacciones CDK2
Interacciones CDK2
Interacciones THR160
Arg50
Arg50
Thr160
Arg150
Arg150
Arg126
CDK2
Arg126
Thr160
CDK2/ciclinaA
Interacciones CDK2
Interacciones THR160
CDK2/ciclinaA
CDK2-P/ciclinaA
Arg50
Arg50
Arg126
Arg150
Arg126
Thr160
Thr160
Interacciones CDK2
Sustrato y ATP/Mg
PSTAIRE
ATP
Mg
Sustrato
T-loop
Interacciones CDK2
ATP/Mg
- CiclinaA
+ CiclinaA
Lys33
Lys33
ATP
Asp145
Glu51
Glu51
Mg
Asp145
Interacciones CDK2
Interacciones sustrato
Lys33
Glu51
ATP
Mg
Asp145
Phe267
Sustrato
Ile270
Arg169
T-loop
Interacciones CDK2-CiclinaA
Interacciones CDK2-ciclinaA
Interacciones CDK2-CiclinaA
CDK2:
T-loop
PSTAIRE
Ciclina A
Sustrato
ATP
Mg
Interacciones CDK2-ciclinaA
Interacciones CDK2-CiclinaA
Interacciones CDK2-ciclinaA
Hidrofóbicas
CDK2
CiclinaA
His71
Leu299
Val69
Phe304
Leu72
Leu263
Ile52
Leu306
Ile49
Ala307
Leu54
Phe267
Interacciones CDK2-ciclinaA
Puentes de Hidrógeno
CDK2
T39
E40
V44
E42
S46
R50
S53
K56
E57
H71
R122
CiclinaA
K289
K288
E295
K266
F267
D145
D305
Y185
H296
A307
E269
R150
V156
Y180
N272
S276
A277
K278
I270
N173
E174
D177
Y178
D181
Y178
Interacciones CDK2-ciclinaA
Van der Waals
Interacciones CDK2-ciclinaA
Van der Waals
CDK2
CiclinaA
Ile52
Leu299
Leu54
Phe207
Ala307
Ala151
Phe267
Phe152
Ile182
Tyr159
Ile270
Conservación de residuos
funcionales
Conservación de residuos
CDKs
1
Interacción con
ciclina
Interacción
Thr160
Interacción
ATP/Mg
98
PSTAIRE
Aa conservados
Conservación de residuos
CDKs
99
Interacción con
ciclina
Interacción
Thr160
Interacción
ATP/Mg
228
T-loop
Aa conservados
Conservación de residuos
Ciclinas
151
Interacción con
CDK
Interacción
intramolecular
Caja ciclina
282
Conservación de residuos
Ciclinas
283
Interacción con
CDK
Interacción
intramolecular
Caja ciclina
350
Inhibición por
Cip
p27
Inhibición por p27
Inhibidores
• Familia Kip/Cip
– Inhibición de la forma totalmente activa
• Ej: p27Cip y p21Cip inhiben CDK2 y CDK4
• Familia INK4:
– Inhibición de la unión de ciclina a CDK.
– Inhibición del complejo activo.
• Ej: p16INK4a inhibe CDK6
• Proteína Wee:
– Inhibición por fosforilación de Thr14-Tyr15 de
CDK.
Inhibición por p27
Interacción con CDK2/ciclinaA
CiclinaA
p27
Dos mecanismos:
- Cambio conformacional
- Mimetización ATP
CDK2
Inhibición por p27
Cambio conformacional CDK2
CDK2-P/ciclinaA + p27
CDK2-P/ciclinaA
CDK2/ciclinaA
RMSD=0.72
Inhibición por p27
Mimetización ATP
+ p27
+ ATP
Lys33
Lys33
Glu51
Glu81
Glu81
Leu83
Tyr88
Glu51
Leu58
Leu83
Leu58
Ciclina del Herpesvirus murino
Ciclina herpesvirus
Ciclinas virales
• γ-herpesvirus
– Relacionado con desórdenes neoplásicos:
• Ej: HSV, γ-herpesvirus murino...
• Mecanismo: presenta homólogos de ciclina
(V-, K- y M-ciclinas) que forman complejos
con CDKs, impidiendo su inhibición.
INDUCCIÓN
CICLO CELULAR
CDKs
CiclinaA-Ciclina Viral
α3’
α2’
α5’
α1’
α4’
α2
Caja ciclina
Asp220
α1
Glu283
α4
α3
RMSD=2.50
Leu255
α5
Leu297
Ciclina herpesvirus
CDK2/ciclinaA - CDK2/ciclina viral
CDK2/CiclinaA
CDK2/Ciclina
viral
CDK2/Ciclina
viral
CDK2/CiclinaA
RMSD=1.084
Conclusiones
Conclusiones
• Regulación de la actividad de CDKs por
cambios conformacionales inducidos por unión
a ciclina y fosforilación.
• Gran flexibilidad alrededor de la hendidura
catalítica y conservación de residuos
funcionales.
• Esta flexibilidad puede indicar una respuesta
evolutiva a la necesidad de regulación ante
diversas señales.
Materiales, Métodos,
y Bibliografía.
Materiales y métodos
Materiales y métodos
SECUENCIAS y PDBs
PROGRAMAS
Nº iden.
CDK
Nº iden.
Ciclina
NP_0017777
CDK1
NP_001228.1
A hum
PDB 1hcl
CDK2
AAH10958.1
D2 hum
NP_001249
CDK3
AAH06510.1
B1 hum
NP_000066
CDK4
P24864
E1 hum
NP_001250
CDK6
AAH49086.1
D2 musc
NP_002721
PKA
NP_031659.1
E1 musc
NP_595624
CDC2
NP_031654.1
A1 musc
NP_009718
CDC28
AAH11478.1
B1 musc
PDB
ESTRUCTURAS
NP_013926.1
Cln1p
1qmz
CDK2-P/ciclinaA
NP_009360.1
Cln3p
1fin
CDK2/ciclinaA
CAA98729.1
Clb3
1hcl
CDK2
AAB68061.1
Clb5p
1g3n
CDK6/ciclina viral/INK28
1jsu
CDK2-P/ciclinaA/p27
1f5q
CDK2/ciclina viral
RasMol v2.5
Hmmer v2.2
Stamp v4.2
Bibliografía
Bibliografía
Papers:
• Bártová, I., Otyepka, M., Křiž, Z. & Koča, J. (2003). Cyclin-dependent protein kinase-2 regulation by
phosphorylation, a molecular dynamics study. Cell. Mol. Biol. Lett., 8, No2A.
• Card, G. L., Knowles, P., Laman, H., Jones, N. & McDonald, N. Q. (2000). Crystal struucture of a γherpesvirus cyclin-cdk complex. EMBO Journal, 19, 2877-2888.
• Morgan, D. O. (1995). Principles of CDK regulation. Nature, 324, 131-134.
• Jeffrey, P. D., Russo, A. A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J. & Pavletich, N. P. (1995).
Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Nature, 376,
313-320.
• Liu, J. & Kipreos, E. T. (2000). Evolution of Cyclin-Dependent Kinase (CDK) and CDK-Activating
Kinases (CAKs): Differential Conservation of CAKs in Yeast and Metazoa. Mol. Biol. Evol, 17(7),
1061-1074.
• Pavletich, N. P. (1999). Mechanism of Cyclin-dependent Kinase Regulation: Strucures of Cdks, their
Cyclin Activators, and Cip and INK4 Inhibitors. J. Mol. Biol. 287, 821-828.
• Russo, A. A., Jeffrey, P. D., Patten, A. K., Massague, J. & Pavletich, N. P. (1996a). Crystal structure of
the p27Kip1cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclinA-CDK2 complex. Nature, 382,
325-331.
• Russo, A. A., Jeffrey, P. D., Patten, A. K. & Pavletich, N. P. (1996b). Structural basis of cyclindependent kinase activation by phosphorylation. Nature Struc. Biol. 3, 696-700.
Libro:
• Branden, C. & Tooze, J. Introduction to Protein Structure. 2a. ed Garland Publishing, 1998.
PREGUNTAS PEM
1.- ¿Por qué mecanismos las ciclinas dependientes de quinasas (CDKs) se regulan?
a) La unión de la ciclina a la CDK comporta la total activación de la molécula de CDK
b) Las tres familias de inhibidores que se conocen actúan inhibiendo la fosforilación del complejo
CDK-ciclina.
c) Las dos anteriores son ciertas
d) La fosforilación de la CDK permite que ésta pueda actuar fosforilando sus sustratos
e) Todas las anteriores son falsas
2.- ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones son ciertas?
1. Predominio de láminas beta en la región N-terminal
2. Predominio de hélices alfa en la región C-terminal, entre la que encontramos la hélice PSTAIRE (zona de unión a
la ciclina).
3. En la región central encontramos el punto de unión a ATP y el T-loop
4. Diferentes estudios de superposición han demostrado que la región que más se mantiene en diferentes CDKs es la
hélice PSTAIRE
a) 1, 2 y 3
b) 1 y 3
c) 2 y 4
d) 4
e) 1, 2, 3 y 4
3.- ¿Qué plegamiento caracteriza a la caja ciclina?
a) Left handed 4 helix bundle + 2 hèlices alpha
b)Right handed 7 helix bundle + 2 láminas beta
c)Right handed 3 helix bundle + 2 hèlices alpha
d)Left handed 5 helix bundle +3 hèlices alpha
e)Cap de les anteriors
4.- ¿Cuantos dominios tienen las ciclinas?
a)2, uno formado por hélices alfa y otro por láminas beta.
b)5, formando una proteína transmembrana.
c)Un único dominio formado por láminas beta
d)2, ambos formados por hélices alpha y con idéntico plegamiento
e)En realidad son 2 proteínas que forman la subunidad ciclina.
5.- Amb què interacciona la forma totalment activa de la CDK?
a) Substrat
b) ATP
c) Les dues anteriors són correctes
d) Ciclina
e) Totes les anteriors
6.- Quin nom rep el conjunt dels tres aminoàcids (Glu51, Lys33 i Asp145) que uniexen l’ATP (i el Magnesi)?
a) Clivella catalítica
b) T-loop
c) Tríada catalítica
d) Butxaca hidrofòbica
e) Hèlix PSTAIRE
7.- ¿Qué residuos se conservan mayoritariamente a lo largo de la evolución en las proteina quinasas?
a) Los que interaccionan con la ciclina
b) Los que interaccionan con inhibidores de cdks
c) Los que interaccionan con ATP
d) Los que interaccionan con treonina fosforilada
e) c) y d) son verdaderas
8.- ¿Qué región del cdk es imprescindible en la interacción con la ciclina?
a) La hélice PSTAIRE
b) La lámina beta de la región N terminal
c) La lámina beta de la región C terminal
d) El T loop
e) La hendidura catalítica
9.- ¿Cuáles son los mecanismos por los que el p27 cip inhibe el complejo cdk-ciclina activo?
a) Mimetizando el ATP y generando un cambio conformacional
b) Mimetizando el sustrato y generando un cambio conformacional
c) Defosforilando la treonina (cuya fosforilación es necesaria para la activación total del complejo cdk-ciclin
d) a) y c) son verdaderas.
e) Todas son falsas.
10.- ¿Cuál es el mecanismo por el cual la ciclina viral impide la inhibición de la actividad cdk-ciclina viral?
a) Cambio conformacional en la cdk y sustitución de residuos de la ciclina viral
b) Cambio conformacional del inhibidor
c) Fosforilación del inhibidor
d) Cambio conformacional de la cdk
e) Fosforilación de la treonina de la cdk