Transcript LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE

LA MÉCANIQUE DE LA
DIVISION CELLULAIRE
Plan
I - Vue générale de la phase M
II - Mitose
III - Cytocinèse
2
II – Mitose
Mitose : fuseau mitotique
• Émanation du cytosquelette : microtubules +
protéines associées
• Séparation des chromosomes filles vers les
pôles
• Ecartement des pôles
4
2 événements
• Fuseau : dans le cytoplasme
• Condensation des chromosomes : dans le
noyau
• Prométaphase : mélange des deux
compartiments 
5
Les microtubules
• Capturent les chromosomes
• Intervention des moteurs
– Proches des extrémités des microtubules
– Famille des kinésines (  extrémité +)
– Famille des dynéines (  extrémité -)
• Extrémités des microtubules
– Site d’assemblage et de désassemblage des microtubules
– Lieu de production de force
• Fuseau
– Équilibre entre les deux forces opposées (moteurs + et
moteurs -)
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Les trois classes de microtubules
– MT astraux
• Irradient dans toutes les directions
• Séparation des pôles
– Poignées d’orientation et de positionnement du fuseau dans la
cellule
– MT du kinétochore
• Liés au kinétochore
• Fixent les chromosomes au fuseau
– MT chevauchant (polaires)
• Symétrie bipolaire du fuseau
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• Les trois classes
de microtubules
– MT astraux
– MT du
kinétochore
– MT chevauchant
(polaires)
Fig 18-10
• Toutes les
extrémités – sont
vers le
centrosome
8
Rappel sur les microtubules interphasiques
• Réseau de microtubules émanant du
centrosome
• Instabilité dynamique
• Croissance  raccourcissement = catastrophe
• Raccourcissement  Croissance = restauration
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Plan
A. Prophase
1. Modification de la stabilité des microtubules :
équilibre MAPs  catastrophines
2. Assemblage du fuseau :
équilibre moteurs à direction +  moteurs à
direction -
B.
C.
D.
E.
Prométaphase
Métaphase
Anaphase
Télophase
10
A – Prophase
1. Modification de la stabilité des microtubules :
équilibre MAPs  catastrophines
2. Assemblage du fuseau :
équilibre moteurs à direction +  moteurs à
direction -
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1 - Modification de la stabilité
des microtubules : équilibre
MAPs  catastrophines
12
Changement brutal des microtubules
en prophase : le constat
•
•
•
•
•
Longs et peu nombreux (interphase) 
Plus nombreux et plus courts
Effondrement de la demi-vie des microtubules
Augmentation de l’instabilité des microtubules
Augmentation du nombre de microtubules
irradiant du centrosome
– Par modification des centrosomes qui
augmentent leur taux de nucléation
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• Les microtubules mitotiques sont différents
des microtubules interphasiques
Fig 18-11
14
Protocole d’étude
• Cellule en culture (lignée PTK1 et
BSC) injectée avec tubulinefluorochrome (dichlorotriazinylaminofluorescein (DTAF-tubulin))
• Irradiation avec un rayon laser
d’une petite surface jusqu'à
extinction de la fluorescence
• Evaluation de la réapparition de la
fluorescence en fonction du temps
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Saxton, WM J Cell Biol 99:2175, 1984
• FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase and
an interphase cell. Examples of relative fluorescence
intensity plotted against time after photobleaching for a
metaphase cell (●) and an interphase cell (○). Circles
represent data points determined by microdensitometry of
negatives. Lines represent best fitting curves using the
function l/lmax = 1 – e –kt (30). The t½ for each curve is noted
on the X axis.
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Changement brutal des microtubules
en prophase : mécanisme de
déclenchement en début de mitose
• M-Cdk phosphoryle
– Des moteurs protéiques
– Des MAPs (Microtubule Associated Proteins) (leur
phosphorylation  diminution de la stabilité des
microtubules)
•  contrôle de la dynamique des microtubules
• Démonstration par biochimie chez Xenopus
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Xenopus
• Extrait d’œuf de Xenopus en phase M ou en
interphase +
• Centrosome + tubuline fluorescente 
• Nucléation des microtubules à partir des
centrosomes
• (Analyse en vidéo microscopie à fluorescence «
time-lapse »)
• Mais #1p1038
– Extraits mitotiques  taux très élevé de catastrophes
– Extraits interphasique  taux plus bas de catastrophes
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Les catastrophines
• Protéines
• Augmentent la
fréquence des
catastrophes
19
Les catastrophines
20
• Kinésines et
Kinesinrelated
proteins
– KIF2
Fig 16-55
• moteur au
milieu de la
chaîne lourde
• pas d'activité
moteur
classique
• se lie aux
extrémités des
microtubules
pour augmenter
leur instabilité
dynamique 
nom de
catastrophine 21
Antagonisme catastrophines / MAPs
22
Antagonisme catastrophines / MAPs
• Microtubules plus dynamiques en phase M
– Par action sur catastrophines et MAPs 
– Augmentation du taux de dépolymérisation des
microtubules (catastrophines)
– Diminution du taux de dépolymérisation des
microtubules (MAPs)
– Augmentation et diminution du taux de
dépolymérisation des microtubules
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Contrôle de la longueur des
microtubules par
l'équilibre entre
catastrophines et MAPs
Catastrophes avec extraits
mitotiques > catastrophes
avec extraits interphasiques
Fig 18-12(A)
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• Centrosomes et noyaux de
spermatozoïdes dans des
extraits mitotiques
– Extraits mitotiques normaux 
fuseau normal
Mitose dans un extrait normal
– Déplétion en XMAP215 
fuseau très anormal
Fig 18-12(B)
– Probablement parce que les
microtubules nucléés par les
centrosomes sont trop courts
Mitose dans un extrait dépléte en XMAP215
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Spindle formation
observed in
control and
XMAP215depleted
extracts.
Microtubule
arrays are seen
in control (left)
and XMAP215depleted (right)
extracts 20 and
45 min after
addition of sperm
nuclei. Spindles
are seen 45 min
after sperm
addition. Scale
bar represents 10
µm.
20 mn
20 mn
Régis Tournebize, Andrei Popov, Kazuhisa
Kinoshita, Anthony J. Ashford, Sonja Rybina,
Andrei Pozniakovsky, Thomas U. Mayer,
Claire E. Walczak, Eric Karsenti & Anthony A.
Hyman Control of microtubule dynamics by
45 mn
45 mn
the antagonistic activities of XMAP215 and
XKCM1 in Xenopus egg extracts
Nature Cell Biology 2, 13 - 19 (2000)
26
Les fuseaux deviennent visibles 45 min après l’ajout des spermatozoïdes
2 - Assemblage du fuseau :
équilibre moteurs à direction +
 moteurs à direction –
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Propriétés des microtubules
• Si monomérique : le moteur se déplace
• Si multimérique : liaison de 2
microtubules adjacents qui peuvent se
déplacer l’un par rapport à l’autre
– Génération de foyers à extrémités moins 
pôles du fuseau
– Glissement de microtubules
l’un par rapport à l’autre 
zone de chevauchement dans
le fuseau
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• Importance des moteurs
multimériques pour
– Assemblage
– fonctionnement des microtubules
Fig 18-13
29
Assemblage du fuseau = équilibre
• Croissance de microtubules à partir de
chaque centrosome  les microtubules ont
des polarités opposées
• Association de moteurs à déplacement + 
– Écartent les centrosomes
• Des moteurs à déplacement - 
– Rapprochent les centrosomes
• Formation du fuseau = équilibre entre les
deux
30
Fig 18-14
Prophase :
séparation des
pôles du fuseau
grâce à
• des moteurs +
(kinésine):
rencontre de
deux
microtubules
polaires de
polarité opposée
• des moteurs –
(dynéine)
associés à
l’enveloppe
nucléaire via les
microtubules
astraux
31
Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce
à
• des moteurs + (kinésine): rencontre de deux
microtubules polaires de polarité opposée
• des moteurs – (dynéine) associés à l’enveloppe
nucléaire via les microtubules astraux
Fig 18-14
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Régulation de la longueur du fuseau :
les moteurs du fuseau
• Vertébrés : 7 familles de moteur apparentés à la kinésine
• S. cerevisiae : 5 familles de moteur
– Augmentation du moteur +  fuseau anormalement long
– Augmentation du moteur -  fuseau anormalement court
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• L'influence de moteurs à sens
de marche opposé sur la
longueur du fuseau mitotique
– Kar 3p : moteur vers – Cin 8p : moteur vers +
Normal
moteur -  fuseau court  moteur +  fuseau long
Fig 18-15
Chez la levure il n’y
a pas de rupture de
l’enveloppe
nucléaire pendant la
mitose
Fuseau
Pôles du fuseau
34
Chez l’homme
• Probablement comme chez la levure
• La phosphorylation d’au moins un
moteur par M-Cdk est nécessaire pour
la fixation du moteur au fuseau
35
B – Prométaphase
• Rupture soudaine de l’enveloppe
nucléaire
– Déclenchée par la phosphorylation directe
des lamines nucléaires par M-Cdk
• Les microtubules accèdent aux
chromosomes pour la 1ère fois
36
Conséquences
• Phénomène de « recherche et capture »
des chromosomes par les microtubules
• Un microtubule qui rencontre un
chromosome s’attache et se stabilise 
plus (zéro) de catastrophes
• Peut rencontrer un kinétochore :
– S’attache par l’extrémité (bout + du
microtubule)
– Le microtubule s’appelle alors
« microtubule du kinétochore »
37
Les microtubules du kinétochore
1 à 40
microtubules
par
kinétochore
Fig 18-16
ADN & les 2
kinétochores
38
39
Les kinétochores
40
• Microscopie électronique d'un kinétochore
Fig 18-19
Structure
trilamellaire
41
Kinétochore
• Rôle capital dans le mouvement des
chromosomes sur le fuseau
• Contiennent des moteurs + et des moteurs –
• Mode d’attachement des microtubules aux
kinétochores inconnu (d’autant plus que ce
bout + se polymérise et se dépolymérise
constamment)
42
Kinétochore
43
Microtubule Capture: A Concerted Effort
Chitra Kotwaliwale and Sue Biggins Cell,
Volume 127, Issue 6 , 15 December 2006,
Pages 1105-1108
•
Attachement du kinétochore
aux microtubules et sa
régulation par Aurora B
•
Le kinétochore – structure
protéique qui se forme au contact
de l’ADN centromérique-est
composé de multiples protéines
de liaison de faible affinité au
microtubule. Alors que le
complexe Ncd80 se lie à la
charpente en réseau du
microtubule, d’autres composants
peuvent se lier à l’extrémité plus
du microtubule.
En réponse à des forces de
tension, Aurora B phosphoryle les
protéines de liaison au
microtubule pour diminuer l’affinité
de ces facteurs aux microtubules.
Ceci conduit au détachement des
microtubules des kinétochores.
Des facteurs comme INCENPsurvivine peuvent exercer de
nombreuses fonctions au niveau
du kinétochore. En plus de leur
rôle de senseurs de tension
régulés par Aurora B, ces
molécules peuvent aussi
promouvoir une activité de liaison
au noyau du microtubule
•
44
Kinétochore
The kinetochore is a specialized
chromosomal structure that facilitates
chromosome attachment and
movement along spindle microtubules
during chromosome segregation.
Furthermore, the kinetochore
communicates the actual state of its
interaction with the spindle to a cell
cycle regulating machinery. It is the
first member of a signaling cascade
that inhibits sister chromatid
separation (the beginning of
anaphase) if chromosomes lack a
stable bi-polar spindle attachment. A
defect in this checkpoint function has
been correlated to human cancers.
My group analyses the protein
composition and structure of the S.
cerevisiae kinetochore by mass
spectroscopy and the function of
individual kinetochore proteins
applying cell and molecular biological
methods.
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Kinétochore
• Hierachical Structure
of the Yeast
Kinetochore
• A small CEN DNA
interacts with CBF3,
an inner kinetochore
complex that recruits
a specialized
nucleosome. Together
these complexes
recruit multiple
discrete protein
complexes, ultimately
resulting in a large
structure that
mediates the
attachment and
movement of
chromosomes on the
mitotic spindle.
46
Attachement des microtubules
aux kinétochores
• Facile à observer dans les cellules de poumon
de têtard
• Liaison par le côté du microtubule
• Puis glissement rapide vers le centrosome
• Puis l’attachement latéral est converti en
fixation par l’extrémité
• En même temps attachement de l’autre
kinétochore par les microtubules du
centrosome opposé 
• Attachement bipolaire du chromosome
47
• Capture
des
Fig 18-17
microtubules
par les
kinétochores
48
Constitution de la plaque
métaphasique
• Les chromosomes sont tirés d’avant
en arrière 
• Position équidistante des pôles
• Plaque métaphasique

49
Fig 18-18
•
•
•
Plaque métaphasique : chromosomes
Kinétochores
Microtubules
5 m
50
Plaque métaphasique
• Oscillation des chromosomes…
• en attendant le signal de la séparation…
• qui est le dernier signal négatif émis par le
dernier kinétochore
51
C - Métaphase
52
• Dynamique des microtubules du fuseau métaphasique
– rhodamine - tubuline en rouge
– colorant bleu pour l'ADN
– Fluorescéine (caged) - tubuline en vert
Fluorescéine invisible parce que « cagée »
1,5 mn
Fig 18-20
« décageage » de la fluorescéine par UV juste à gauche de la plaque
métaphasique
2,5 mn
10 m54
• Microscopie à fluorescence de microtubules
isolés
Fig 18-21
55
• Alignement des chromosomes sur la plaque
métaphasique par des forces opposées
Fig 18-22
56
Fig
• Assemblage du
fuseau sans
centrosome dans
un embryon
parthénogénétique
18-23d'insecte Sciara
(absence d'aster)
57
D - Anaphase
1. Anaphase A
2. Anaphase B
58
• Assemblage
d'un fuseau
bipolaire sans
centrosome ni
kinétochore
Fig 18-24(A)
– Billes
recouvertes
d'ADN
bactérien en
présence
d'extrait d'oeuf
de Xenopus
59
• Assemblage d'un fuseau
bipolaire sans centrosome ni
kinétochore
– Billes recouvertes d'ADN
bactérien en présence
d'extrait d'oeuf de Xenopus
Fig 18-24(B)
60
• Séparation des
chromatides en
anaphase
– Microtubules colorés
par des AC anti
tubuline marqués à
l'or
Fig 18-25
61
• Forces qui séparent les
chromosomes en
anaphase A
Fig 18-25A
62
• Forces qui
séparent les
chromosomes
en anaphase B
Fig 18-25B
63
• Deux modèles de migration du kinétochore
vers le pôle pendant l'anaphase A
Fig 18-27
64
• Diminution de la zone de
chevauchement des
microtubules chevauchant
de la métaphase à
l'anaphase chez les
diatomés
Fig 18-28
65
• Fonctionnement des moteurs protéiques
pendant l'anaphase
Fig 18-29
66