Transcript STRUCTURE DE LA MEMBRANE 1

STRUCTURE DE LA MEMBRANE
1
II - LES PROTÉINES MEMBRANAIRES
• Porteuses de la plupart des fonctions
des membranes
• Variable en fonction du type de cellule
– myéline : protéines  25 % de la masse
– membrane interne des mitochondries :
protéines  75 % de la masse
– en général : protéines  50 % de la masse
• 50 molécules de lipide pour une
molécule de protéine
• Souvent glycosylées
2
A - Rapports lipides protéines
3
Modes d'insertion des protéines dans la
double couche lipidique (1/2)
Simple hélice 
Cylindre 
Fig 10-17
(1à4)
Multiple hélice

4
Modes d'insertion des protéines dans la
double couche lipidique (2/2)
 Phosphatidyl
inositol
Au départ protéine
transmembranaire
à un passage dans
le RE
 Chaine
d'acide gras
ou groupe
prényl.
Au départ
protéine
cytosolique
soluble
Fig 10-17 ( 5
à 8)
5
Protéines liées aux lipides
Exemple 5
• Synthèse de la protéine dans le cytosol
comme une protéine soluble
• Fixation d'un lipide par liaison covalente
• Transport vers la membrane
6
Exemple 5 : attachement d'une protéine membranaire par une
chaîne d'acide gras ou un groupement prényl
Fig 10-18
7
Exemple 5 : attachement d'une
protéine membranaire par une
chaîne d'acide gras ou un
groupement prényl
• Aide à localiser une protéine soluble
dans la membrane
• Peut être transitoire
8
Exemple 6 : protéines
liées aux lipides
• Synthèse de la protéine dans le RE comme
une protéine transmembranaire à un passage
• Dans le RE le segment transmembranaire de la
protéine est clivé
• Un GlycosylPhosphatidylnositol (GPI) est
ajouté
• La protéine se retrouve liée à la face non
cytosolique de la membrane
• Facile à reconnaître grâce à une phospholipase
C spécifique du phosphatidylInositol
9
Modes d'insertion des protéines dans la
double couche lipidique (Rappel)
Fig 10-17 ( 5
à 8)
10
Exemples 7 et 8 :
protéines périphériques
• Liaisons non covalentes avec d'autres
protéines de la membrane
• Peuvent être libérées par les procédés
d'extraction doux (force ionique ou pH)
11
Protéines intégrales
• = protéines intrinsèques
• Nécessitent des procédés énergiques
pour être libérées
12
Protéines membranaires
• Transmembranaires
– agissent des deux côtés de la membrane
– transport de molécules
– comprennent les récepteurs
• reconnaissance extra cellulaire
• message intra cellulaire
• Non transmembranaires
– associées aux lipides et/ou protéines d'une
seule face de la membrane
– eg : médiation chimique intra cellulaire
(moitié cytosolique de la membrane)
13
Protéines
transmembranaires
• Toujours orientation unique dans la
membrane
• Dû à la synthèse dans le réticulum
endoplasmique
• Presque toujours en hélice 
• Ou cylindre 
14
Hélice 
Fig 10-19
15
Prédiction de la localisation d'hélice  d'une
protéine par profil d'hydrophobicité
Fig 10-20 (AB)
16
Proportion prévisible de protéines
membranaires dans le génome
Fig 10-20 C
17
Cylindres 
• Forment une structure rigide
• facile à cristalliser ( hélice )
• Le nombre de plis  peut varier de 8 à
22
18
• Cylindres 
Fig 10-21
(1de2)
E. coli
E. coli
Récepteur à un virus bactérien
Lipase
19
• Cylindres 
Fig 10-21(2de2)
Rhodobacter
capsulatus
L'intérieur est
comblé par un
domaine
globulaire de
protéine qui
contient un site
de fixation du
fer
E. coli
Transporteur d'ions
20
Les Cylindres 
• Abondants dans la membrane externe des
mitochondries
• Forment des pores (eg : porine)
• Souvent boucles qui font saillie dans la
lumière
• Parfois porines spécifiques (maltoporines)
• Surtout membranes externes des bactéries,
mitochondries, chloroplastes
• Beaucoup plus rares que hélices  chez les
eucaryotes
• Plus rigides que l'hélice 
21
• Simulations d'une hélice de protéine
transmembranaire dans une bicouche lipidique.
Simulations de (a) 18-mer, (b) 26-mer and (c)
34-mer modèles de l'hélice  de la protéine
transmembranaire M2 du virus influenza A dans
une bicouche lipidique
Forrest,LR2000(Fig1)
Review
Membrane simulations: bigger and better?
22
Simulations de canaux ioniques dans
une bicouche lipidique. (a) Hélice M25
(b) Canal potassique KcsA
Forrest,LR2000(Fig2) Review
Membrane simulations: bigger and better?
23
B - Glycosylation des
protéines membranaires
24
• Protéine
transmembranaire
à un passage
glycosylée
• Glycosylation dans
le RE et Golgi 
• La face glycosylée
est la face non
cytosolique
• Ponts S—S sur la
face non
cytosolique
Fig 10-22
25
C - Détergents
• Petites molécules amphiphiles
• Permettent de solubiliser les protéines
transmembranaires
– Extrémité polaire chargée (ionique) :
sodium dodécyl sulfate (SDS)
– Extrémité polaire non chargée (non
ionique) : triton
26
• Micelle de détergent dans l'eau
Fig 10-23
27
Solubilisation
de protéines
membranaires
par un
détergent
léger: il y a
solubilisation
des protéines
membranaires
et des
phospholipides
de la
membrane
Fig 10-24
28
• SDS : détergent
anionique
• Triton X-100 :
détergent ionique
• Portion
hydrophobe du
détergent en vert
• Portion hydrophile
du détergent en
bleu
Fig 10-25
29
SDS - Page
• Solubilisation des protéines par SDS :
solubilisation de la protéine avec
dénaturation (déroulement)
• Parfois réversible
• Electrophorèse en Gel de
PolyAcrylamide (PAGE)
• A révolutionné l'étude des protéines
membranaires
30
• Utilisation de
détergents légers
pour solubiliser,
purifier et
reconstituer des
systèmes de
protéines
fonctionnels
• Très bel exemple
Fig 10-26
31
D - Les globules rouges
• = Hématies = érythrocytes
• Facilement disponibles
• Faciles à isoler
• Pas de noyau, pas d'organite interne
• Une seule membrane = membrane
plasmique
• Création de fantômes membranaires
32
Fig 10-27
Globules rouges en microscopie électronique à balayage
33
• Préparations de fantômes de globules
rouges
– refermés ou non
– retournés ou non
Fig 10-28
34
Méthodes
• Marquage "vectoriel" : marqueur
radioactif ou fluorescent soluble (ne se
fixe que sur la face exposée)
• Enzymes protéolytiques
• Anticorps marqués
• SDS-PAGE
35
Résultats
• Certaines protéines traversent la
bicouche lipidique
• La composition des deux feuillets
lipidiques est différente
36
• SDS-PAGE des
protéines de la
membrane du
globule rouge
humain  environ 15
protéines majeures
(15000 à 250000 D)
• Spectrine +
glycophorine +
bande 3 > 60 % en
masse des protéines
membranaires
Fig 10-29
37
a- Spectrine
• Protéine du cytosquelette associée à la face
cytosolique de la membrane du globule rouge
• Principal constituant du cytosquelette qui donne sa
forme biconcave au GR
• Permet au GR de se déformer pour passer dans les
petits capillaires
• Mutations dans le gène de la spectrine  anémie
avec GR sphériques (=sphérocytose héréditaire =
Minkowski-Chauffard)
• 25 % en masse des protéines associées à la
membrane
• Longueur = 100 nm (250 000 copies / cellule)
38
• Molécules de spectrine du GR humain
– Hétérodimère qui forme des tétramères
– deux chaînes polypeptidiques  et  anti
parallèles enroulées
– extrémité phosphorylée pour former le
tétramère
Fig 10-30 A
39
• Molécules de spectrine du GR humain en
microscopie électronique
Fig 10-30 B
40
• Hétérodimère qui forme des tétramères (200 nm de
long)
• 4 ou 5 tétramères sont liés dans des complexes de
jonction qui contiennent actine (13 monomères) bande
4.1, adducine et tropomyosine
Fig 10-31 A
100 nm
41
Liaison de spectrine à la membrane
• Ankyrine
– Liaison de la spectrine à la membrane
– Se lie à
• spectrine
• bande 3 (protéine transmembranaire)
– Limite la diffusion latérale de bande 3
• Bande 4.1
– Liaison de la spectrine à la membrane
– Se lie à
• spectrine et ankyrine
• bande 3 et glycophorine
42
• Spectrine du
cytosquelette
de la face
cytosolique du
GR humain en
microscopie
électronique
(coloration
négative)
Fig 1031B
43
Autres cellules que le GR
• Beaucoup plus compliqué
• Cortex du cytosol riche en actine
• Cf. chapitre cytosquelette
44
b - Glycophorine
•Une des premières protéines
membranaires à être séquencée
•1 million de molécules par cellule
•131 acides aminés
•Fonction inconnue
•N'existe que dans le GR
•Type de la molécule transmembranaire
à un passage
Glycophorine
• En général homodimère
• Extrémité -N à l'extérieur
• 100 résidus glucose (90 % des sucres
de la membrane du GR)
• Un passage : hélice  hydrophobe de
23 acides aminés
46
• Transformation d'une chaîne
protéique à plusieurs passages en
deux chaînes protéiques à
plusieurs passages
Fig 10-32
A et B = même résultat
A : un gène
B : deux gènes
47
c - Bande 3
• Protéine transmembranaire de 930
acides aminés
• 12 passages
• Transport du CO2 des tissus vers les
poumons
• Transporteur d'anions qui permet à
HCO3- de traverser la membrane
• Se voit en cryofracture
48
Photo de Branton
Daniel Branton (1932 - )
49
• Congélation dans l'azote
liquide
• Fracture du bloc de
glace avec un couteau
• Le plan de fracture
passe entre les deux
feuillets hydrophobes de
la membrane
• Les plans de fracture
sont ombrés au platine
• Examen de la réplique
au microscope
électronique à
transmission
Fig 10-33
50
Cryofracture
• Face P(rotoplasmique) face E(xterne)
51
Fig 10-34
• Globule rouge humain en cryofracture
• Surtout bande 3
52
ME cryofracture
53
Devenir
probable des
molécules de
glycophorine
et bande 3 du
GR humain
pendant la
cryofracture
Fig 10-35
La protéine tend à
rester avec le
feuillet qui contient
la plus grosse
partie de la
protéine
54
E - Bactériorhodopsine
• Protéine de transport de la membrane
plasmique dont on connaît bien la
structure 3D dans la bicouche lipidique
• Pompe à protons activée par la lumière
de la membrane plasmique de certains
archaea
• Structure semblable à de nombreuses
autres protéines de membrane
55
• Halobacterium salinarum
– Archeae
– Vivent en eau salée et au soleil
– Possèdent des "patch" dans leur membrane
plasmique appelée "membrane pourpre"
– Chaque patch ne contient qu'une sorte de
protéine : la bactériorhodopsine
Fig 10-36
56
Halobacterium Salinarum cells, as seen with a
dark-field optical microscope
www.ib.pi.cnr.it/groups/ halob/flabat.html
57
Halobacterium salinariumis an extreme halophile that grows at 4 to 5
M NaCl and does not grow below 3 M NaCl. This freeze etched
preparation shows the surface structure of the cell membrane and
reveals smooth patches of "purple membrane" (bacteriorhodopsin)
embedded in the plasma membrane.
• http://images.google.fr/imgres?imgurl=
soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbe
s/halobacterium2.gif&imgrefurl=http://s
oils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes
/halo.html&h=300&w=244&prev=/imag
es%3Fq%3Dhalobacterium%2Bsalinaru
m%26svnum%3D10%26hl%3Dfr%26lr
%3D%26ie%3DUTF-8%26sa%3DN
58
Lyophilized purple membranes
• Extremely halophilic microrganisms of the Archaea domain
produce a purple membrane, the chromophore consisting of a
retinal-protein complex called bacteriorhodopsin
59
Top view of
the purple
membrane
patch. The
hexagonal
unit cell is
displayed in
the middle of
the patch,
surrounded
by white line
defining the
unit-cell
dimensions.
60
Krebs,MP20
00p15
(fig2)
• (A) Vue latérale d’un
monomère de
bactériorhodopsine
comme on le voit dans
le trimère
• (B) Vue cytoplasmique
de la membrane
pourpre
61
Bacteriorhodopsin : contient un groupe
absorbant la lumière ou chromophore
(le rétinal)
http://www.biologia.uniba.it/fisiologia/corcelli/en/br.htm
62
Rétinal
• = vitamine A dans sa forme aldéhyde
• Le même chromophore que dans la
rhodopsine de la rétine
• Lié de façon covalente à une lysine de
la protéine
63
Krebs,MP2000p15 (fig4)
64
Fontionnement de la rhodopsine
• Un photon  le chromophore change
de forme  modification de la
conformation de la protéine 
• Transfert d'un ion H+ du cytosol vers
l'extérieur de la cellule
65
• Bactériorhodopsine
7 hélices 
de 25
acides
aminés
chacune
Fig 10-37
66
Fontionnement de la
rhodopsine
• Le transfert du proton entraîne un
gradient
• qui entraîne la formation d'ATP
• grâce à une seconde protéine 
• Sorte de pile solaire
67
Bactériorhodopsine
• Modèle pour beaucoup d'autres
protéines à 7 passages
– Bactériorhodopsine (transporteur)
– Transmetteurs de signaux
68
• Autre exemple
(que bactériorhodopsine)
• Structure 3D du
centre de
photosynthèse de
Rhodopseudomonas
viridis
– 4 sous-unité : L,M,H,
cytochrome
Fig 10-38
• Première protéine
transmembranaire à
être cristallisée et
analysée
69
F - Diffusion latérale des
protéines
• Flip flop : non
• Diffusion rotatoire : oui
• Diffusion latérale : oui
– Hétérocaryons
– FRAP
– FLIP
70
• Hétérocaryon
Homme/Souris
de L.D. Frye &
M. Edidin
(1970)
Fig 10-39
71
• Fluorescence recovery After Photobleaching
Fig 10-40
FRAP
72
• Fluorescence Loss In Photobleaching
Fig 10-40 FLIP
73
Domaines membranaires
• Membrane = mer de lipides + protéines
qui flottent dedans  simpliste
• Confinement de protéines dans des
domaines spécifiques de la cellule
– Cellule épithéliale (intestin ou rein)
– Distribution asymétrique des protéines
– Distribution asymétrique des lipides
– Pas d'échange de lipides ou protéines entre
les domaines des feuillets externes
• Rôle des tight junctions (jonctions
étanches = jonctions serrées)
74
• Limitation de la mobilité d'une protéine
membranaire dans un domaine : cellule
épithéliale
Fig 10-41
75
Application au spermatozoïde
• Création domaines membranaires sans
jonctions intercellulaires
• Trois domaines distincts (au moins)
– région acrosomique
– région post acrosomique
– queue
• Barrière inconnue
76
Fig 10-42
• Spermatozoïde de cobaye
• Anticorps spécifique de
chaque région
77
Autres exemples
• Cellule nerveuse
– Axone
– Dendrite
• Beaucoup d'autres
78
Mécanismes d'immobilisation
des protéines
• Halobacterium : "membrane pourpre" :
cristal qui immobilise et limite la
diffusion
• Assemblages macromoléculaires à
l'intérieur ou à l'extérieur de la
membrane
– eg : GR cf. supra
79
• Quatre mécanismes de
restriction de la mobilité
latérale de protéines
spécifiques de la
membrane plasmique
– (A) - auto-assemblage en
gros agrégats (eg :
"membrane pourpre")
– (B) - assemblage à
l'extérieur de la cellule
– (C) - assemblage à
l'intérieur de la cellule
– (D) - entre deux cellules
Fig 10-43
80