Transcript Analytické metody Vladimíra Kvasnicová

Analytické metody
Vladimíra Kvasnicová
1. SPEKTROFOTOMETRIE
2. CHROMATOGRAFIE
3. POTENCIOMETRIE
4. VOLUMETRIE
Spektrofotometrie
spektrofotometr
Materiál používaný pro analýzu:
ROZTOK
PRINCIP
• interakce mezi stanovovaným analytem a
monochromatickým zářením
• část záření je absorbována
stanovovanou látkou, zbývající
záření je detekováno detektorem
• množství absorbovaného záření je přímo
úměrné množství analyzované látky
Spektrofotometrie je kvantitativní metoda:
stanovujeme
KONCENTRACI
 koncentrace  tmavší roztok   absorpce
Důležité termíny
vzorek = analyzovaný roztok
neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci
standard = vzorek o známé koncentraci
blank = roztok neobsahující analyzovanou látku
chromofor = část struktury chemické látky,
která je schopna absorbovat
záření určité vlnové délky
fialová
380 – 450 nm
modrá
450 – 495 nm
zelená
495 – 570 nm
žlutá
570 – 590 nm
oranžová
590 – 620 nm
červená
620 – 750 nm
viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum
Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum (2006)
Používané elektromagnetické záření
• barevné vzorky:
viditelné (VIS)
• bezbarvé vzorky:
UV záření
A/
„absorpční spektrum“
Komplementární barvy
SCHÉMA spektrofotometru
Které veličiny jsou měřeny?
TRANSMITANCE
= poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I)
k intenzitě záření do kyvety vstupující (Io)
(tj. záření dopadající na detektor / původní záření)
T = I / Io
T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)
Jak se vyjadřuje množství pohlceného
záření?
veličina odvozená od transmitance:
ABSORBANCE
A = - log10 T
= - log10 (I/I0) = log10 (I0/I) = log10 (1/T)
A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více)
horní limit závisí na citlivosti detektoru
T
prošlo (%)
pohlceno (%)
A
1
100
0
0
0.99
99
1
0.004
0.90
90
10
0.05
0.50
50
50
0.3
0.10
10
90
1.0
0.01
1
99
2.0
0.001
0.1
99.9
3.0
0.0001
0.01
99.99
4.0
T
prošlo (%)
pohlceno (%)
A
1
100
0
0
0.99
99
1
0.004
0.90
90
10
0.05
0.50
50
50
0.3
0.10
10
90
1.0
0.01
1
99
2.0
0.001
0.1
99.9
3.0
0.0001
0.01
99.99
4.0
 citlivosti detektoru
Zjištění koncentrace:
1. Lambert-Beerův zákon
2. Kalibrační křivka
3. Výpočet pomocí hodnot (A, c)
standardních vzorků
Zjištění koncentrace:
Lambert-Beerův zákon
A=xlxc
nebo
T = 10- ( x l x c)
A = absorbance (A = -log T)
T = transmitance (T = 10-A)
 = molární absorpční („extinkční“) koeficient
l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace
Kalibrační křivka
3 a více standardů
zpracovaných
stejnou metodou
lineární kalibrační
křivka
A=xlxc
y = kx + q
Výpočet pomocí standardů
Ast = cst x l x 
Avz = cvz x l x 
Ast / cst = l x 
Avz / cvz = l x 
lx=lx
Ast / cst = Avz / cvz
cvz = Avz x (cst / Ast)
cvz = Avz x f
f = průměr všech (cst / Ast) použitých při experimentu
Cvičení
1) Avz = 0,25
Ast = 0,40
Cvz = ?
Cst = 4mg / L
2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49.
neznámý vzorek: T = 0,55, Cvz = ? (v mg/L i mmol/L)
MW = 180g
3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44
Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se
standardem.
Přesnost stanovení
absorpce ostatními látkami přítomnými
ve vzorku musí být eliminována:
BLANK (slepý pokus)
→ jeho absorbance se odečte od absorbance
vzorku  výsledná absorbance odpovídá pouze
koncentraci analyzované látky
Spektrofotometrie v praktickém cvičení
„Stanovení koncentrace kreatininu v moči“
analyzovaný vzorek:
vlastní moč
1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný
produkt chemickou reakcí
2. koncentrace kreatininu ve vzorku se
zjišťuje z naměřené absorbance pomocí
kalibrační křivky
Chromatografie
chromatograf
Všechny
chromatografické
techniky nejsou
instrumentální...
TLC chromatografie
= úkol v praktiku
PRINCIP
Separace směsi různých látek je založena na
rozdílné distribuci látek mezi dvě
nemísitelné fáze:
•
stacionární fáze (pevná nebo kapalná)
•
mobilní fáze (kapalná nebo plynná)
Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi
rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.
• pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká,
látka putuje systémem rychleji než látka
s nižší afinitou
• pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi
vysoká, látka je ve stacionární fázi déle
zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji
než látka mající nižší afinitu
Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)
Co je cílem analýzy?
1. rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky
2. identifikovat látky (= kvalitativní analýza)
3. stanovit koncentraci přítomných látek
(= kvantitativní analýza)
Klasifikace chromatografických technik
1) podle mobilní fáze
 kapalinová chromatografie (LC)
 plynová chromatografie (GC)
2) podle uspořádání
 planární (rovinná) chromatografie
 chromatografie v koloně
kapalinová
v koloně
„manuální“
chromatografie
kapalinová
v koloně
„instrumentální“
chromatografie
příklad:
kapalinová planární
chromatografie
Plynová chromatografie (GC)
Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)
3) podle fyzikálně-chemických interakcí
 adsorpční chromatografie
 rozdělovací chromatografie
 gelová permeační chromatografie (GPC)
 chromatografie na iontoměničních (IONEX)
 afinitní chromatografie
Fyzikálně-chemické mechanismy
separace
adsorpce
rozpouštění
iontová výměna
Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma
sítový efekt –
gelová chromatografie
specifická interakceafinitní chromatografie
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Vyhodnocení chromatogramu
1) planární chromatografie (př. TLC)
Porovnání skvrn se
standardy:
„b“
Rf = a /b
Rf = retardační faktor
(„rate of flow“)
a = vzdálenost start-střed skvrny
b = vzdálenost start-čelo mobilní f.
Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
„a“
2) chromatografie v koloně (HPLC, GC)
Porovnání „píků“ se
standardy:
tR = retenční čas
 identifikace látek
h = výška píku
 koncentrace látek
„píky“
Chromatografie v praktickém cvičení
„ TLC lipofilních barviv“
= adsorpční planární kapalinová chromatografie
• mobilní fáze: toluen (nepolární)
• stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)
• stadardy barviv → porovnání Rf
• neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva
„Demonstrace HPLC a GC“
HPLC
= High Performance Liquid Chromatography
(vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
• normální nebo reverzní fáze
• princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.)
GC
= Gas Chromatography
(plynová chromatografie)
Potenciometrie
potenciometr
PRINCIP
Potenciometrie je elektrochemická metoda
založená na měření napětí elektrochemického
článku za bezproudého stavu.
dvě elektrody:
• indikační (měřící) elektroda
• referentní (srovnávací) elektroda
Schéma:
Elektrody
indikační elektroda
její potenciál závisí na složení roztoku
referentní elektroda
její potenciál je stabilní (konstantní, známý)
Měřit přímo potenciál jako takový nelze
 měříme rozdíl potenciálů (=napětí)
indikační elektrody
Obrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006)
Nernstova rovnice
E=
0
E
+ (RT/nF) ln aM
E = elektrodový potenciál
E0 = standardní elektrodový potenciál
R = molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1)
F = Faradayova konstanta (96 458 C mol-1)
T = absolutní teplota (25 0C = 298 K)
n = náboj stanovovaného iontu (M)
a = aktivita stanovovaného iontu
E = E0 + (RT/nF) ln aM
ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F 
E = E0 + (0.059/n) log aM
! DŮLEŽITÉ !
• elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku,
aktivitě („koncentraci“) a náboji stanovovaného
iontu
• elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat:
ke kalibraci potenciometru používáme standardy
Obecná klasifikace elektrod
1) elektrody I. druhu (kovové nebo plynové)
2) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl)
→ REFERENTNÍ ELEKTRODY
3) redoxní elektrody (Pt, Au)
4) membránové elektrody
→ ISE = iontově selektivní elektr.
(stanovení iontů v medicíně: H+, Na+, K+, Cl-,...)
„Standardní vodíková elektroda“ (SHE)
• plynová elektroda
• její potenciál byl definován: ESHE = 0
za všech podmínek
REFERENTNÍ
ELEKTRODA,
ale v praxi se
běžně nepoužívá
Referentní elektrody
kalomelová
argent-chloridová
SHE
„Skleněná elektroda“
= ISE (H+)
stanovení
pH
membránová
electroda
Membránové elektrody na stanovení plynů
pH-metr
skleněná
elektroda
referentní
elektroda
skleněná
elektroda
tělo
sensoru
CO2 +H 2 O HCO-3 +H+
film elytu
vnitřní
elektrolyt
permeabilní
membrána
CO2 (g)
analyzované
permeabilní
membrána
prostředí
analyzované
prostředí
elektroda používaná na stanovení CO2 v krvi
Potenciometrie v praktickém cvičení
„ Měření pH fosfátového pufru“
• roztoky fosfátového pufru o různém složení
• stanovení pH pomocí pH-metru
(= upravený potenciometr)
• kalibrace přístroje pomocí standardů
• skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)
Skleněná
kombinovaná
elektroda
plnicí
otvor
vnější
refeferentní
elektroda
stínění – přívod
k vnější ref.elektrodě
vnitřní vodič – přívod
k vnitřní ref.elektrodě
solný můstek (keramická frita)
skleněná
membrána
vnitřní referentní
elektroda
Skleněná
kombinovaná
elektroda
v praktiku
Volumetrie
(= titrace, odměrná analýza)
Metoda založená na chemické reakci mezi
analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem
titrace
= zjištění
přesné
koncentrace
vzorku
byreta
s odměrným
roztokem
titrační baňka s naředěným
analyzovaným vzorkem
PRINCIP
K analyzované látce se pomocí byrety
postupně přidává
roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho,
dokud není dosaženo stechiometrického
poměru reagujících látek (= bod ekvivalence)
bod ekvivalence
= reagující látky jsou ve stechiometrickém
poměru daném chemickou rovnicí popisující
probíhající reakci
Odměrný roztok (OR)
• známé, přesně definované složení
• jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí
stadardu o známé a neměnné koncentraci
• reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez
vedlejších reakcí
• reakci lze popsat chemickou rovnicí
• v bodě ekvivalence dochází „skokem“
k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno
snadno indikovat
Zjištění přesné koncentrace OR
• titrací standardu o přesně známé koncentraci
• porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané)
spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou):
Vt / Va = f
• f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100)
• aktuální konc. OR (= titr): ca = f x ct
• faktorem při výpočtu koncentrace vzorku
násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR
Výpočet koncentrace vzorku
• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce
aA+bB→cC+dD
a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n)
A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka
a / b = n(A) / n(B)
a / b = n(A) / n(B)
c=n/V →
n=cxV
c = molární koncentrace (mol/l)
n = látkové množství (mol)
V = objem roztoku
a, b = stechiometrické koeficienty
a x n(B) = b x n(A)
a x cB x VB = b x cA x VA
a x cB x VB = b x cA x VA
• známe stechiometrii chemické reakce
• známe koncentraci odměrného roztoku a jeho
objem spotřebovaný při dosažení bodu
ekvivalence
• známe objem vzorku použitého pro analýzu
jediná neznámá je koncentrace vzorku
cB
Cvičení
1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH,
(f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H2SO4; C = ?
2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO4 (0,1M),
vzorek: 20ml FeSO4 ; C = ? (mol/ L, % ),
MW = 152g
3) H3PO4 → Na2HPO4
vzorek: 20ml H3PO4 (C = 0,3M ),
odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?
Titraci provádí jedna osoba:
po kapkách přidává OR z byrety
za stálého promíchávání obsahu titrační baňky
Indikace bodu ekvivalence
1) pomocí indikátoru
 jednoduché, ale subjektivní hodnocení
 bod ekvivalence  objemu OR po jehož přidání
změní titrovaný roztok trvale své zbarvení
 indikuje „první nadbytečnou kapku“ přidaného OR
 ve skutečnosti je při změně zbarvení
roztok „přetitrován“
2) pomocí přístroje (např. potenciometru)
 objektivní
 vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA
Titrační křivka
titrace kyseliny hydroxidem
měřená
veličina
indikátory
odměrný roztok
titrace hydroxidu kyselinou
odměrný roztok
Klasifikace titrací
1) neutralizační (acidobazické)
•
H+ + OH- → H2O
2) oxidačně-redukční (redox)
•
•
př. AgNO3
vznik nerozpustné sraženiny
př. EDTA
vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny
4) komplexometrické
•
ox./red. činidlo
oxidace: red → ox + eredukce: ox → red + e-
3) srážecí
•
kyselina /báze
Titrace v praktickém cvičení
„Stanovení acidity žaludeční šťávy“
• reaguje HCl ze žaludeční šťávy
• odměrný roztok: NaOH
→ neutralizační titrace (= alkalimetrie)
• indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)
• z konc. HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy
• zjišťuje se pH před a po stimulaci
(= na lačno a „po jídle“)
Návody na praktika
+ teorie metod:
http://www.lf3.cuni.cz/chemie/
viz. Studium / praktika