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LA SIFILIDE
“ He who knows syphilis knows medicine”
Sir William Osler (1849-1919)
La sifilide è una malattia infettiva trasmessa
principalmente per via sessuale, causata dal
Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio
mobile spiraliforme appartenente all’Ordine
Spirochetales, Famiglia Treponematacee.
Il batterio filiforme,
appare filamentoso ed
avvolto a spirale e le sue
Dimensioni in lunghezza
sono nell’ordine di 5 micron – 15 micron con un
diametro trasverso tra
0,1 micron e 0,2 micron.
Si moltiplica per scissione semplice con divisione
trasversale ed al contrario di molti consimili della
sua famiglia, per le sue particolari esigenze
nutritive e metaboliche, non può essere coltivato
in vitro o meglio può esserlo solo per breve tempo
con un massimo sopravvivenza di 7 giorni a 35°, in
terreno particolarmente arricchito ed in
presenza di CO2.
Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da
trasfondere conservato nelle emoteche.
In azoto liquido mantengono la loro vitalità,
mentre proliferano in maniera eccellente
nei testicoli di coniglio.
Una patologia che viene da lontano…..
nel tempo?
Rothschild B.M.
Existence of syphilis in a Pleistocene bear
Nature. 335 (6191):595, 1988 Oct 13
Wright D.J.
Syphilis and Neanderthal man
Nature . 229 (5284):409, 1971 Feb 5
…o nello spazio?
LA CLINICA
EVOLUZIONE NATURALE DELLA
SIFILIDE
Studio di Oslo
1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al 1941
sifilide I ---> sifilide II
|
latenza ---> 25% recidive
|
< 2 anni
|
sifilide latente tardiva (sifilide III)
DEFINIZIONI
Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide
l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla
seguente classificazione:
a) infezioni primarie e secondarie
b) infezioni latenti recenti ( <2 anni)
c) infezioni latenti tardive (>2 anni)
d) infezioni tardive sintomatiche
e) infezioni connatali in soggetti con meno di due anni
f) infezioni connatali in soggetti con due anni o più
Si definisce sifilide latente recente un’infezione
diagnosticata sierologicamente, la cui durata non
oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce
sifilide latente tardiva.
LATENZA
Periodo di silenzio clinico caratterizzato dall’assenza
di lesioni e/o sintomi compreso tra:

contagio e comparsa del sifiloma
(1° latenza o incubazione)

regressione delle lesioni primarie e comparsa delle
eruzioni cutanee secondarie (2° latenza o recente)

regressione delle eruzioni cutanee secondarie e
comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee e/o
sistemiche (3° latenza o tardiva)
DIAGNOSI
La diagnosi di sifilide si basa su:
- clinica
- anamnesi
- laboratorio
Sarebbe un grave errore trascurare anche uno
solo dei tre elementi
IL LABORATORIO NELLA
SIFILIDE
L’OSSERVAZIONE DI
UN ESSERE VIVENTE
PUO’ AVVENIRE PER
RICONOSCIMENTO
DIRETTO….
O INDIRETTO….
IL LABORATORIO NELLA
SIFILIDE
DIAGNOSI DIRETTA
Dimostrazione in sede di lesione della
presenza
del Treponema pallidum,
indice certo di malattia
DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICA
Dimostrazione degli anticorpi anti
Treponema pallidum, indice di infezione
DIAGNOSI DIRETTA
dimostrazione del Treponema pallidum
1905: Identificazione del Tp al microscopio ottico
(Schaudinn F & Hoffmann E)
1907: Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio
(Parodi U Giornale dell’Accademia Medica di
Torino 13:288;1907 )
1909: Microscopia in campo oscuro (Coles)
1948: Rabbit Infectivity Test (Magnuson)
1964: Immunofluorescenza diretta (Yobs AR)
1990: PCR (Hay)
Diagnosi diretta del treponema
•
Cross section of
a spirochete
PF=periplasmic
flagell OS=outer
sheath
TEM x60.000
IL Treponema pallidum, appartiene alla famiglia delle
Treponematacee, batteri di forma elicoidale, mobili, a
divisione trasversale.
lunghezza variabile da 8 a 14 micron
larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron.
Treponema pallidum
• Microscopia
elettronica al
Scansione (SEM)
Microscopia
elettronica a
scansione (SEM)
Microscopia elettronica a
trasmissione (TEM):
spirocheta infiltrata nei
tessuti
Struttura antigenica
Un antigene polisaccaridico
Un antigene lipidico
Un antigene proteico
Antigeni del corpo del treponema
La conoscenza antigenica
del treponema pallido ha
consentito l’uso di metodi
diagnostici diretti specie
specifici
(DFA-TP)
Trasmissione del Tp dall’uomo al
testicolo di coniglio
Il treponema pallido non
cresce in vitro ma può
essere coltivato nel
testicolo di coniglio e
identificato su preparato
istopatologico colorato
con sali di argento
Istopatologia: Treponema pallidum coltivato su
testicolo di conoglio (whartin-Starry silver stain)
1909: Microscopia in campo oscuro
Contrasto di fase: Questa tecnica si usa per evidenziare preparati
trasparenti che non possono assorbire luce. Il preparato è reso
visibile perchè viene contrastato con un'altra angolazione di luce e
quindi canbiandogli il proprio indice di rifrazione.
Campo oscuro: Viene inserito un disco opaco (chiamato “stop”) sul
percorso della luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce illumina il
soggetto e permette la risoluzione di dettagli fini. L’illuminazione è
obliqua e entra nell’obiettivo solo se rifratta dall’oggetto osservato,
il fondo rimane scuro.
1909: Microscopia in campo oscuro
(PARABOLOIDE)
La microscopia in campo
oscuro è il metodo più
veloce e diretto per
diagnosticare la sifilide
primaria e secondaria. I
campioni devono essere
esaminati
immediatamente dopo il
prelievo da parte di
personale addestrato al
riconoscimento del
Treponema pallidum.
1964: Immunofluorescenza diretta
(DFA-TP)
L’immunofluorescenza
diretta mediante ab
specifici (DFA-TP) può
essere utilizzata per
identipicare il T.
pallidum. I vantaggi di
questa tecnica rispetto alla
microscopia in campo
oscuro è che lo striscio non
deve essere esaminato
subito ed è specie
specifico. Richiede tuttavia
attezzature specifiche e
personale con esperienza.
anticorpo monoclonale fluorescente
diretto verso l’antigene lipoproteico di 47
kd. Courtesy of Sheila Lukehart
Il genoma del Treponema p. è stato
completamente sequenziato
Fraser CM, Norris
SJ, et al: Science
1998 Jul
17;281(5375):375388
Il genoma di T.
pallidum consiste di
1.138.006 paia di
basi e contiene 1041
predicted open
reading frames
(ORF)
BIOLOGIA MOLECOLARE
La conoscenza della sequenza genomica e di alcune
proteine specifiche da esso codificate ha
consentito l’uso di indagini biomolecolari :
• PCR x gene codificante proteina 47Kd
sensibilità 10-50 spirochete
• PCR x DNApolimerasi I
sensibilità 10-50 spirochete
• RT-PCR
sensibilità 1 spirocheta
Attendibilità diagnostica
SENSIBILITÀ: amnios (100%),
lesione mucose o cutanee esulcerate (96%),
sangue (67%)
liquor (60%)
SPECIFICITÀ: lesione cutanea (96%),
amnios e sangue(100%)
LIMITI:
Costi
Incapacità distinguere TP vitali e tracce di TP morti
Non indicato su liquor
Tempi di esecuzione
PCR x gene codificante proteina
immunogena di membrana 47Kd
• Zoechling N. et al 1997: PCR nested per il gene di una
proteina di membrana immunogenica di 47 Kd----banda 196 pb
• H S Jethwa et al. J Clin Microbiol. 1995 January;
33(1): 180–183 ------banda 658pb
• Karina A. Orle Et al 1996. Multiplex PCR
Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes.
AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system)
colorimetric detection sistem
PCR x gene codificante
DNA polymerase I.
Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B.
New tests for syphilis: rational design of a PCR method for
detection of Treponema pallidum in clinical specimens using
unique regions of the DNA polymerase I gene.
J Clin Microbiol. 2001 May;39(5):1941-6.
Sensibilità 95,8%; specificità 95.7%
agarose gel electrophoresis
of polA PCR from serial
dilutions of known
concentrations of T. pallidum
DNA extract. (A) Primer set
I. The arrow indicates a 377bp product. (B) Primer set
II. The arrow indicates a
395-bp product. Lanes 1, 2
N.L. Treponema pallidum Kit
•Estrazione mediante gel di silice
•Banda specifica per Treponema p. 273 pb
•Controllo interno 668pb
Tempo di
esecuzione:
in giornata
N. L. Treponema pallidum Kit
•Estrazione
mediante gel
di silice
•amplificazione
N. L. Treponema pallidum Kit
•Banda specifica per Treponema p. 273 pb
•Controllo interno 668 pb
668 pb Controllo interno
273 pb Treponema
Treponema pallidum PCR
casistica centro MST
1° Clinica Dermatologica Torino
n. campioni POSITIVI NEGATIVI
NO LUE
18
0
18
LUE I
44
38
6*
LUE II
13
2
12
0
1**
2
LUE
SIEROLOGICA
RECENTE
* 3 lesioni alla cervice uterina 3 solco balano-prepuziale
** roseola del tronco
Isolamento del Tp
da lesioni muco-cutanee
MICROSCOPIA IN
CAMPO OSCURO
PCR
• sensibilità buona (80%)
• sensibilità elevata (96%)
• specificità buona
• specificità elevata
• operatore-dipendente
• operatore indipendente
• risposta immediata
• risposta in giornata
• labilità del campione
• invio dei campioni
• economico
• costo elevato
• adatto a qualsiasi laboratorio
• laboratorio attrezzato
Indicazioni alla diagnosi diretta
La dimostrazione del T. pallidum
è raccomandata in:
•sifilide primaria sieronegativa
•sifilomi extragenitali (orale, anale)
•Sifiloma cervicale
•re-infezioni
•coinfezione con HIV
•Sifilide secondaria atipica
E’ poco utile nelle forme
secondarie e terziarie
DIAGNOSI SIEROLOGICA:
dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum

Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica solo
una risposta immunitaria dell’ospite alla presenza
del Treponema, presente o passata.

Non esiste un unico test sierologico che fornisca
informazioni certe sullo stadio della malattia.

Solo l’esecuzione di più test in contemporanea
associati alla clinica ci può permettere di definire
l’esatto stadio.
DIAGNOSI SIEROLOGICA
dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum
1906:Reaz. di Wassermann
1946: Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)
1949: Treponema Pallidum Immobilisation (TPI)
1956: Rapid Plasmin Reagin (RPR)
1964: Fluorescence Treponemal Antibody-absorption
(FTA-abs)
1965: Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA)
1975: ELISA
1988: Western Blot
CLASSIFICAZIONE DEI TEST
NON-TREPONEMICI : VDRL
(aspecifici)
RPR
Test
TREPONEMICI : TPHA
(specifici)
FTA-abs
ELISA/EIA
Western Blot
Test NON-TREPONEMICI
(VDRL, RPR)
Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti contro
lipidi di membrana del Treponema pallidum e contro
lipidi serici presenti nell’ospite per il danneggiamento
di membrane mitocondriali causato da diverse patologie.
A questo scopo si utilizza la cardiolipina di bue che
cross-reagisce con questi antigeni
Pangborn MC. A new serologically active phospholipid from beef
heart. Proc Soc Exp Biol Med. 1941;48:484.
Harris, A., A. A. Rosenberg, and L. M. Riedel. 1946. A
microflocculation test for syphilis using cardiolipin antigen.
Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform. 27:169-174.
VDRL
Harris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio. 1948. The
VDRL slide flocculation test for syphilis. II. A
supplementary report. J. Ven. Dis. Inform. 29:72-75.
Venereal Disease Research Laboratory. VDRL tests. In:
Scheele L A. , editor; Scheele L A. , editor. Manual of
serologic tests for syphilis. U.S. Washington, D.C:
Government Printing Office; 1949. pp. 109–120.
La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione del
complemento, descritta per la prima volta da
Wassermann, Neisser & Bruck, in 1906, conosciuta sotto il
nome di reazione di Wassermann
VDRL
L’antigene VDRL, che è una miscela di cardiolipina, lecitina e
colesterolo, è la base di tutti i test non treponemici.
Con varie modificazioni l’antigene è stato stabilizzato per essere
usato in altri test aggiungendo stabilizzatori e pigmenti:
USR (unheated serum reagin test) con siero non scomplementato
RPR (rapid plasma reagin test) con plasma non scomplementato
TRUST (toluidine red unheated serum test) (TRUST) con siero
non scomplementato e aggiunta di blu di toluidina.
La velocità del test ha favorito l’RPR, ma la VDRL rimane l’unico
test consigliato dalla FDA americana per diagnosticare la
neurosifilide su liquor. Inoltre la VDRL rimane il test più
economico e perciò è preferito nei laboratori con scarse
disponibilità finanziarie (“paesi poveri”).
VDRL
Antigene:
cardiolipina di bue +
lecitina +
colesterolo
anticorpi
del
paziente
flocculazione
VDRL
1 inattivazione
complemento
3 reattivo
2 siero
4 agitazione
VDRL
5 lettura
Tempo di
esecuzione
45-50 minuti
VDRL NEG
VDRL POS
RPR (Rapid Plasma Reagin)
Portinoy J, Garson W, Smith Ca.
Rapid plasma reagin test for syphilis.
Public Health Rep. 1957 Sep;72(9):761-6.
RPR e' un test non-treponemico di flocculazione
per la determinazione qualitativa e semiquantitativa
delle reagine (anticorpi) in siero o plasma
Il test viene effettuato su siero o plasma.
l'antigene è costituito da una sospensione colloidale
di cardiolipina, lecitina e colesterolo miscelata a
microparticelle di carbone. Quando un siero
reattivo viene posto a contatto con l'antigene, si ha
la formazione di una flocculazione macroscopica.
RPR
RPR è una variazione della tecnica
standard VDRL, ha analoga specificità
e sensibilità lievemente diversa
offre i seguenti vantaggi:
Reagente pronto all’uso
Stabilità elevata
Non è richiesta l’inattivazione del
campione
Può essere usato sia siero che plasma
Lettura ad occhio nudo dei risultati.
Svantaggi: non può essere usata su
liquor
Test NON-TREPONEMICI
(VDRL, RPR): pregi e difetti

test quantitativi, se titolati
follow-up

alta sensibilità

basso costo ed esecuzione semplice e rapida

positivizzazione precoce (80% positivi nella Sifilide I)

negativizzazione entro 2 anni dalla terapia

variabilità d’interpretazione legata all’operatore

fenomeno prozona

bassa specificità (30% falsi positivi)
TEST TREPONEMICI
(TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB)

test qualitativi (TPPA e FTA
titolo)

alta sensibilità (falsi neg eccezionali)

buona specificità (rari falsi pos)

positivizzazione variabile (IgM > FTA >TPPA)

negativizzazione assente (o molto tardiva)

costo variabile

tempi più lunghi, laboratorio attrezzato
TPHA/TPPA
TPHA (T. Pallidum HemAgglutination)
TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)
Il TPHA, ideato nel 1965 è stato recentemente
sostituito dal TPPA, più sensibile e utilizza particelle
di gelatina al posto di emazie di pollo o altri volatili
TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)
Particelle di
gelatina
antigeni
treponemici
particelle sensibilizzate
particelle sensibilizzate
anticorpi del
paziente
agglutinazione
TPHA/TPPA
1 tampone sorbent 2 siero
3 particelle
sensibilizzate
e non
Tempo di
esecuzione:
circa 2h30’
4 lettura
TPHA/TPPA
2 siero
titolazione
FTA
(Fluorescent Treponemal Antibody)
Deacon WE, Falcone VH & Harris A.
Fluorescent Test for Treponemal Antibodies.
Proc. Soc. Exper. Biol. & Med.
96: 477-489, 1957
FTA-abs
Hunter Ef, Deacon We, Meyer Pe.
An Improved Fta Test For Syphilis, The
Absorption Procedure (Fta-abs).
Public Health Rep. 1964 May;79:410-2.
FTA IgG e IgM
E’ il test storicamente usato per
l’dentificazione delle IgM (lue congenita),
oggi affiancato da ELISA e WB
Tempo di
esecuzione
2h30’ ore
vetrino con
Treponemi adesi
FTA-abs
anticorpi del paziente
legame
(siero adsorbito) antigene - anticorpo
anticorpi anti Ig
umane
rivelazione
ELISA/EIA

test qualitativo rapido, di facile interpretazione ed
automatizzato per la ricerca di Ig (G+M), IgG e IgM

indicato per lo screening di grandi popolazioni a
bassa prevalenza di sifilide (donatori, gravide, etc)

I casi positivi devono essere confermati con un altro
test

sensibilità elevata - no fenomeno prozona

specificità buona

basso costo solo per grandi popolazioni
ELISA/EIA
Tempo di
esecuzione
< 2 ore
WESTERN BLOT
Test qualitativo utilizzato come test di
conferma nei casi dubbi:




sifilide congenita: ricerca IgM
neurosifilide: esclusione di infezione in
caso di negatività
sensibilità buona: nella s. congenita
(83-98% > FTA-abs)
specificità alta : > TPHA > FTA-abs
promettente per neurosifilide e
treponematosi endemiche
Tempo di
esecuzione
1h30’
Treponema pallidum immobilization
(TPI o test di Nelson)
Test altamente specifico
Oggi in disuso
• Necessita di uno stabulario attrezzato
per l’allevamento dei conigli e le colture
dei Treponemi
• Utilizzo di apposite celle per l’esecuzione
del test
• Gli anticorpi del paziente insieme al
complemento immobilizzano i treponemi.
Il problema dei
FALSI NEGATIVI
e
FALSI POSITIVI
REAZIONI FALSAMENTE NEGATIVE
FENOMENO di PROZONA
Falsa negatività della VDRL per un meccanismo
competitivo dovuto all’ inibizione della agglutinazione
per una eccessiva quantità di anticorpi circolanti
(TPHA  1:5120)
Si verifica in corso di: sifilide secondaria
sifilide latente recente
reinfezioni
HIV+
Si evita titolando la VDRL negativa fino a 1/16
La diluizione va eseguita solo in caso di sospetto clinico
REAZIONI FALSAMENTE POSITIVE
Molto frequenti (1% pop. generale, 30% tossicodipendenti)
La discordanza coi test treponemici permette la diagnosi

più frequenti nei test non treponemici (VDRL, RPR)

titolo stabile e basso (VDRL< 1: 8)

reazione falsamente positiva generalmente isolata

identificabili con i test di conferma

impossibilità a distinguere le treponematosi
endemiche (Framboesia, Bejel, ecc)

la reazione falsamente positiva può coesistere con
cicatrice sierologica rilevabile solo dall’anamnesi
POSITIVITA’ RISCONTRATE SU 400 SIERI CHE
DIMOSTRAVANO F.R.P. ALLA VDRL
(cortesia Dr. Panuccio Sanità pubblica Milano)
Anti-HCV
n. campioni
positivi
%
89
22,3%
RA TEST (artrite reumatoide)
ASMA
(anti muscolo liscio)
53
52
13,3%
13%
Anti.HIV
APCA
40
14
14
4
4
130
10%
3,5%
3,5%
1%
1%
ANA
AMA
HbsAg
(epatite C)
(AIDS)
(anti cellule parietali)
(anti nucleo)
(anti mitocondrio)
(epatite B)
ALTRE CAUSE
31,4%
TEST di CONFERMA
necessario per
• Esclusione di test falsamente positivi
VDRL
TPHA, FTA-abs
ELISA
TPHA + VDRL
TPHA
FTA-abs, Western Blot
ELISA IgM (neonato)
WB- IgM
• Esclusione di test falsamente negativi
 fen. prozona:
VDRL
VDRL diluita, ELISA
APPLICAZIONE DEI TEST
SCREENING: VDRL/RPR + TPHA
ELISA (G+M)
TEST di
CONFERMA: TPHA
FTA-abs (FTA-IgM x sifilide congenita)
Western Blot
FOLLOW-UP: VDRL titolata
SCREENING PER POPOLAZIONI
banca del sangue
ostetricia (gravide)
reparti neuro-psichiatrici
ELISA(G+M)
VDRL/TPPA
centro MST
VDRL/TPPA
chirurgia d’urgenza
espianto d’organo
test rapido:
RPR o TPPA
Screening per la sifilide
negli utenti asintomatici di un Centro MST
VDRL / TPPA
VDRL + / TPPA -
VDRL - / TPPA +
VDRL + / TPPA +
ripetere TPPA
> 15 gg
anamnesi
titolo VDRL
neg
pos
infezione
iniziale
pos
neg
falso
positivo
ELISA,WB
FTA-abs
neg
pos
infezione
pregressa
 1:8
infezione
recente
 1:4
infezione
pregressa
INTREPRETAZIONE SIEROLOGIA
VDRL
TPHA
IgM*
-
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
No sifilide
Sifilide pre-sierologica
Sifilide I iniziale
FTA-abs falso +
Sifilide I iniziale
VDRL falsa +
Sifilide I iniziale
+
+
+
Sifilide I-II, latente recente
+
+
-
-
+
-
Sifilide latente tardiva
VDRL falsa + in sifilide pregressa
Sifilide pregressa
VDRL falsa – (f. prozona)
 1/8
* FTA-abs, ELISA, WB
DIAGNOSI
SIERO NEONATALE
In caso di madre con sierologia positiva
il siero neonatale sarà positivo
per il passaggio transplacentare
delle IgG materne ma non per le IgM
IgG
IgM
Gli anticorpi materni si negativizzano < 6° mese: test non treponemici
< 15° mese: test treponemici
La diagnosi sierologica di sifilide neonatale si basa
sulla dimostrazione delle IgM
con FTA-abs, ELISA e Western Blot
(golden-standard e test di conferma)
IgM negative:
assenza di infezione neonatale
positivizzazione tardiva per infezione > VIII° mese
ripetere test mensilmente per 3 mesi o trattare
IgM positive: infezione neonatale
possibile falso positivo
(Fatt. Reumatoide)
 conferma con WB
VALUTAZIONE DEL LIQUOR
pleiocitosi
 5 cell/cc
proteinorrachia
VDRL
 40 mg/dl
+ (nel 50-70% dei casi)
TPPA/FTA-abs
[Western
Blot ]
Nelle forme recenti tutti i parametri sono alterati
Nelle forme tardive i test anticorpali possono essere
l’unico parametro alterato
INTERPRETAZIONE
dei test su liquor
VDRL
TPPA
+
+
NEUROSIFILIDE
-
+
Falso positivo, frequente
+
-
Falso positivo, eccezionale
-
-
No neurosifilide
Il Treponema pallidum…..
sfuggente come le Cerastes del Sahara…