Transcript Biochemické metody

Biochemické metody separace
proteinů
Charakterizace proteinu
1. Molekulová hmotnost celého proteinu
2. Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců
3. Určení primární struktury
4. Aminokyselinové složení
5. Aminokyselinové sekvence
6. Trojrozměrná struktura
7. Izoelektrický bod proteinu
8. Spektroskopické vlastnosti
Separační metody
A. Separace založené na velikosti molekul
(dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním
gradientu, gelová filtrační chromatografie)
B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti
proteinů
(izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními
solemi, frakcionace organickými rozpouštědly)
C. Separace založené na základě elektrického
náboje
(elektroforetické metody, iontově výměnná
chromatografie, afinitní chromatografie)
A. Separace založené na velikosti molekul
Dialýza a ultrafiltrace
•
•
•
•
Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem
Propustnost membrány pro rozpuštěné látky
Velikost povrchu membrány
Pohyb částic < 1000 Da
Centrifugace v hustotním gradientu
• Lineární hustotní gradient
(sacharóza, CsCl)
• centrifugace při vysokých otáčkách
(150 tis. g)
• sedimentace proteinů určitou
rychlostí podle velikosti, hustoty,
tvaru molekul (je dosažena
rovnováha mezi hustotou roztoku a
částicí)
• po centrifugaci jsou proteiny v
gradientu rozděleny a zahuštěny
Chromatografie
Gelová filtrační chromatografie
(molekulová vylučovací
chromatografie)
• Hydrofilní gelové částice (polymer)
• Uvnitř každé částice jsou póry
• Látky se rozdělují podle velikosti
(molekulové hmotnosti)
Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky
Kalibrační křivka
Jednotlivé frakce proteinů
se detekují spektrofotometrem.
Rychlost průtoku proteinu
je úměrná velikosti molekuly.
Optimální vlastnosti gelu pro gelovou filtraci:
• inertní matrice vůči děleným složkám i elučním roztokům
• chemická stabilita během několika kroků, při různém pH a
při různé teplotě
• mechanická stabilita při vyšším tlaku (nesmí se deformovat)
• optimální velikost gelových částic (příliš malé částice -
rozdělení je přesnější, ale pomalejší a naopak)
B. Separace založené na rozdílech
rozpustnosti proteinů
Izoelektrická precipitace
• rozpustnost globulárních proteinů ovliňuje pH
při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat –
mají 0 náboj
• protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný
(NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu)
• princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi
proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI.
pH roztoku je nižší
+
náboj proteinu
pI
pH roztoku je vyšší
náboj proteinu
Rozpustnost proteinu prudce
stoupá:
pH roztoku < pI proteinu
pH roztoku > pI proteinu
Vysolování proteinů neutrálními solemi
Princip
Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a
vytvářejí s ní vodíkové můstky
(čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný)
 Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť
 Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok
 Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním interakcím
• Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost
globulárních proteinů.
• Povaha aniontu (Cl-) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než
povaha kationtu Na+).
• Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné
anionty - MgCl2 a (NH4)2SO4 více než NaCl.
• Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75
%).
Frakcionace (rozdělení) proteinů organickými
rozpouštědly
• etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda)
•(dielektrická konstanta - polarita rozpouštědla)
• sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi
opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost.
• udržováním roztoku při teplotách kolem 0o C se snižuje
nebezpečí denaturace proteinu.
C. Separace na základě elektrického náboje
Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a
počet ionizovatelných skupin aminokyselin)
Elektroforetické metody
• Dělení látek s odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném
elektrickém poli.
• Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při
elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty):
při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě
při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě
Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin)
• Proužek acetátcelulózy – nanesení
vzorku.
• Elektroforéza ( rozdělení podle
různých elektroforetických
pohyblivostí).
• Rozdělené proteiny na zóny.
• Densitogram
(densita je přímo úměrná koncentraci)
Iontově výměnná chromatografie
• Proteiny se pohybují kolonou rychlostí, která je
dána jejich celkovým náboj v roztoku o daném pH.
• pH a obsah solí mobilní fáze, která obklopuje
molekuly proteinů ovlivní jejich ionizaci.
•Syntetický polymer (např. pryskyřice) obsahuje
nabité funkční skupiny:
 záporně nabité kuličky – katexy (vazba
kationtů)
 kladně nabité kuličky – anexy (vazba
aniontů)
• Katex zadržuje kladně nabité částice, záporně
nabité se pohybují s rozpouštědlem (mobilní fází).
• Navázané proteiny se z vazby uvolní změnou
iontové síly nebo změnou pH roztoku protékajícího
chromatografickou kolonou
D. Separace pomocí specifického ligandu
Afinitní chromatografie
Využití biologických vlastností
proteinů
- specifická nekovalentní
vazba s jinou molekulou (ligand)
enzym + koenzym
hormon + receptor
antigen + protilátka
inhibitor+substrát
lektin+cukr
použití nosiče - agarózové
partikule (Sephadex)
Gelová elektroforéza
• Gel polyakrylamidu nebo agarózy.
• Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji).
SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza
SDS, sodium dodecyl sulfate, dodecyl síran sodný – iontová povrchově aktivní látka