Transcript Instrumental Analysis 概 论 微生物检验

Instrumental Analysis
概
论
免疫检验
微生物检验
细菌学检验
卫生微生物
病毒学检验
水质检验
卫生检验
理化检验
空气检验
食品检验
生物材料检验
分析化学
仪器分析是在化学分析基础上的发展
（1）不少仪器分析方法的原理，涉及到有
关化学分析的基本理论；
（2）不少仪器分析方法，还必须与化学分
析手段相结合，才能完成分析的全过程。
仪器分析的特点（与化学分析比较）
（1）灵敏度高，检出限量低，所需样品
量少
（2）选择性好
（3）操作简便，分析速度快，容易实现
自动化
（4）相对误差较大(5%)
（5）需要价格比较昂贵的专用仪器。
仪器分析主要内容
紫外-可见分光光度: Ultra-Visable Spectrophotometry (UV-SP)
荧光分光光度法:
Fluorescence spectrometry
原子吸收分光光度: Atomic Absorption Spectrophotometry(AAS)
电化学:
Electrochemistry
色谱:
Chromatography
High performance liquid chromatography(HPLC)
Gas chromatography(GC)
紫外-可见分光光度法
本章重点:
1.光吸收定律：朗伯—比耳定律
2.分光光度法的误差
3.显色条件的选择
4.测量条件的选择
5.定量方法
紫外-可见分光光度法
利用溶液中的分子或基团在紫外和
可见光区(200~760nm)的吸收光谱，对
物质进行定性和定量测定。属分子吸收
光谱分析。
光谱分析导论
光谱分析法是根据物质与电磁能相互作用,
产生能级跃迁，发射或吸收电磁辐射而建立
起来的一类分析化学方法。
电磁辐射：一种以巨大速度通过空间传播
的光量子流。
光谱分析
X射线荧光分析法
原子发射光谱分析法
发射光谱法
原子、分子荧光分析法
光谱分析法
化学发光分析法
吸收光谱法
紫外-可见分光光度法
原子吸收光谱
分子吸收光谱
红外光谱法
核磁共振波谱法
什么是吸收光谱？
吸收光谱如何形成？
分子吸收光谱和原子吸收光谱的比较？
如何利用吸收光谱对物质定性定量？
吸收光谱
物质对光的吸收程度随波长变化的曲线
吸收光谱的产生机理
1.物质分子的内部运动及能量：
E内能=Ee+Ev+Er
Ee> Ev> Er。
ΔE电子>ΔE振动>ΔE转动
量子理论
分子、原子的能级量子化及光子的能量、能级
量子化——吸收和辐射的能量也是量子化的。
当一束光照射到某物质上时，组成该物质的分
子与光子发生碰撞，分子吸收只能吸收等于两个能
级之差的能量（ΔE=E1-E2=hc/λ）。分子才会由
较低能级跃迁到较高能级:
（激发态）
M(基态) + hν → M*
物质对光的选择性吸收, 物质对不
同波长的光有不同程度的吸收，由而产
生了该物质的吸收光谱，即物质对光的
吸收程度随波长变化的曲线。每种物质
结构不同，各自的吸收光谱不同。
如何得到吸收光谱？
测定某一溶液对不同波长单色光的吸
光度（A），然后以波长为横坐标，以吸
光度为纵坐标绘图，所描绘的图形称为
吸收光谱（吸收曲线）。反映了该物质
对不同波长光的吸收能力。
制作方法
（1）照相法
（2）分光光度计：取适当浓度的被测物的标
准溶液，置分光光度计中，顺序从短波长到长
波长每间隔适当距离测定其吸光度值（A）。
以波长为横坐标，A为纵坐标作图，所得到的
曲线即为该物质的吸收光谱。
（3）可自动制图的仪器
吸收光谱的特点和作用
a.一定的物质有一定形状的吸收光谱，有
一定的最大吸收波长。
b.同一物质浓度不同,吸收光谱的形状及
lmax不变。
例：不同浓度高锰酸钾溶液的吸收光谱
作用
（1）物质定性的依据之一
（2）定量
（3）选择测定波长
原子吸收光谱和分子吸收光谱的主要区别
(1) 分子吸收光谱：物质分子吸收了一定
波长的光引起能级的跃迁所产生的光谱。电子
能级间的跃迁可能同时伴随着振动能级和转动
能级间的跃迁，谱线彼此重叠而形成连续的吸
收带,带状光谱。
原子吸收光谱：当物质分子中的元
素如先被分解成原子或离子，原子
或离子吸收相应的辐射能电子从基
态跃迁到激发态，则纯属电子跃迁，
线光谱。
比色法：利用比较溶液的颜色深度以测知物质
浓度的方法。
溶液的颜色深度和吸收光谱有何关系
溶液颜色的深浅＝光吸收程度的大小
物质呈色的机理
太阳光通过玻璃三棱镜，投射在光
屏上形成一个红、橙、黄、绿、青、蓝、
紫的可见光谱带。因此，这7种色光按
一定强度比例混合成了白光。
某两种光按一定强度的比例混合成
白光，就叫这两种色为互补色。
颜色互补规律
物质为何呈色？
物质对光的选择性吸收——物质的显色
一个有色物质的溶液之所以呈色，是因为选择
性地吸收了一定波长的光。
当一束白光通过有色溶液时，一些波长的光被
溶液吸收，另一些则透过，透射光刺激人眼而使人
感觉到溶液呈现某种颜色，即溶液的颜色由透射光
的波长所决定。透射光与吸收光互为互补光，二者
可组成白光。
物质的颜色与光的关系
光谱示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
复合光
表观现象示意
物质颜色深浅代表其对光的吸
收程度，二者原理相同.
例： 1，10邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收光谱
由图可以看出：吸收曲线
上有一个吸收高峰，对应在
5 1 0 nm 处 ， 而 对 波 长
600nm以上的光几乎不吸
收，也就是该溶液对绿色光
吸收最多，而橙色光完全透
过，故1，10磷二氮杂菲亚
铁溶液为?色
按波长范围分为：
远紫外区（10~200nm）
近紫外区（200~400nm）
可见光区（400~760nm）
空气中的O2、CO2、H2O要吸收
10~200nm波段的光，除非抽成真空，不能
用于做实验（远紫外区又叫真空紫外区），
而近紫外区、可见光区是人的眼睛能感觉到
的。
有机化合物的吸收光谱 （自学）
电子跃迁：主要了解π→π*， n→π*
几个概念
（1）红移：有机化合物的特征吸收随溶剂和取
代基的变化而改变，向长波方向移动的现象。
（2）兰移：有机化合物的特征吸收随溶剂和取
代基的变化而改变，向短波方向移动的现象。
（3）增色效应：有机化合物的吸收强度
随溶剂和取代基的变化而增强的现象。
（4）减色效应：有机化合物的吸收强度
随溶剂和取代基的变化而减弱的现象。
（5）生色团：指有机化合物分子结构中
含有π—π*或n-π*跃迁，能在紫外可见
光区产生吸收的原子团。
（6）助色团：能使饱和碳氢化合物或生
色团的吸收峰红移、吸收强度增加的基
团（如卤素）。
光的吸收定律
朗伯比耳定律-光度分析的定量依据。
物理意义：当用一束平行的单色光通过
一均匀的溶液时，溶液的吸光度与溶液的
浓度和液层厚度的乘积成正比。
A=lg(I0/It)=KbC
当C一定时，A  b——Lambert’s law
当b一定时，A  C——Beer’s law
入射光 I0
透射光 It
二、概念
T=It/ I0，称为透光度(transmittance) ，指透过
光强度与入射光强度之比。
实验证明：LgIo/It=1/T=0.434 k，bc=kbc
A=Lg1/T=LgIO/It=kbc，A-吸光度值
(absorbance) ，表示物质对光的吸收程度。
同义词：光密度 optical density,OD
消光度 extinction，E
三、比例系数K
1、a（absorptivity）-吸光系数：浓度为1g/L的
溶液放在厚度为1cm的吸收池中，于一定波长
下测得溶液的吸光度
2、ε(molar absorptivity)-摩尔吸光系数：浓度
为1mol/L的溶液放在厚度为1cm的吸收池中，
于一定波长下测得溶液的吸光度。
3、E1%1cm-比吸光系数或百分吸光系数：浓度为
1%（W/V）的溶液放在厚度为１ｃｍ的吸收
池中，于一定波长下测得溶液的吸光度。
三 种 吸 光 系 数 的 换 算 ： ε＝ ａ × Ｍ =
E1%1cm.M/10，其中常用的是ε。
4、测定：选择三个浓度的溶液分别测量其Ａ
值，在利用朗伯比耳定律进行计算，以均值
算得摩尔吸光系数。
5、表观摩尔吸光系数：用待测金属离子的总
浓度代替反应达到平衡时有色化合物的浓度
而计算出的摩尔吸光系数。
将精制成纯品的氯霉素在水中配成
0.002%的溶液，盛于1cm比色皿中，
在278nm最大吸收波长处测得A为
0.614，求此波长下的摩尔吸光系数和
比吸光系数E1%1cm。（分子量为
323.15）
四、关于e的两点补充
（1）e是物质的重要特性常数：ε不依赖于吸
光物质的浓度，吸收层厚度和入射光强度，
而与吸光物质的性质、入射光波长、溶剂等
因素有关。一定物质在一定溶剂中，一定条
件下，特别是一定波长下的ε是常数。
（2）ε是衡量分析灵敏度的重要标志：物质
的摩尔吸光系数越大，则吸光能力越强。
通常ε值在１０～１０ ５之间，ε>１０４
为强吸收，ε为１０３～１０４为中强吸收，
ε<１０３为弱吸收。
用氨测定铜，ε=120；用铜试剂（DDTC）测铜，
ε=12800，用双硫腙测铜，ε=158000。
分光光度计
722分光光度计
一、分光光度计的组成部件
记录系统
0.575
光源
单色器
检测器
吸收池
显示
二、光源
1、足够的光强度
2、在广泛的光谱区域内发射连续光谱
3、光强稳定性良好并不随波长而明显变化。
常见光源：热辐射光源和气体放
电光源
(1)钨丝灯：产生３２０ｎｍ～２
５００ｎｍ连续光谱。光强度随电
源电压发生很大的波动，所以要用
稳压装置。
（2）卤钨灯：钨丝灯中加卤素
或卤化物，如碘钨灯。发光
效率比普通钨灯大 ，寿命也
长。
氢灯或氘灯：提供１８０～３７５
nm的连续辐射，是紫外分光光度
计的光源，因玻璃吸收紫外线，灯
泡必须用石英材料制成。
休息了吧！