Transcript vibrio during the four seasons in the south coast of taiwan parahaemolyticus

Studies on vibrio
parahaemolyticus by PCR
during the four seasons in the
south coast of taiwan
指導老師:張福林副教授
研究生:陳念群
Introduction
致病三大弧菌
V.vulnificus
V.cholerae
V. parahaemolyticus
•霍 亂 弧 菌 與 腸 炎 弧 菌 是 食 品 界 及
防 疫 單 位 最 重 視 的 食 品 中 毒 菌
(資料來源:行政院衛生署)
V. parahaemolyticus
V.cholerae
1950年首次發現
1854年首次發現
H、O、K
01群(稻葉型霍亂弧菌及小川型霍亂弧菌)
及
非01群(0-139 霍亂弧菌 )
Thermostable direct hemolysin
(TDH)
cholera toxin ( CT )
水（為主），食物及生活接觸
水（為主），食物及生活接觸
2-48小時的潛伏期
24-48小時的潛伏期
會伴隨輕度發燒
病人通常不會發燒
呈水性且黏液狀、15%之患者含血便
有時有些黏液，不含血便，略帶甜味似
洗米過後的水
不會有低血壓
低血壓
攝氏75度時，15分鐘以上
攝氏100度時，3分鐘
兩者在生化試驗上的區別:TCBS及嗜鹽性試驗
• TCBS
V. parahaemolyticus : 直徑1~2mm、有光澤、綠色
V. cholerae : 直徑2~4mm 、平滑、黃色、中心不透明、周圍透明
• 嗜鹽性試驗(0% 、 1% 、 6% 、 8% 、 10%)
V. parahaemolyticus : 6% 、 8%生長良好
V. cholerae : 0% 、 1%生長良好
• Vibrio parahaemolyticus is one of the most
important food-borne pathogens in Taiwan,
Japan and other coastal countries.
• Vibrio parahaemolyticus is a gram-negative,
halophilic bacterium that occurs naturally in
estuarine environments world-wide.
(Environmental Microbiology 5(8),706-710 ,2003 )
致病因子
•
•
•
•
•
•
Thermostable direct hemolysin (TDH)
TDH/
TDH-related haemolysin (TRH)
Urease positive
Lethal toxin
附著因子
• Pathogenic V.parahaemolyticus generally
produces a thermostable direct hemolysin
(TDH).
• More than 90% of clinical V.parahaemolyticus
isolates, but fewer than 1% of food or
environmental strains produce TDH.
(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2003)
Aim
橫跨四季有系統地蒐集﹑保存與研究台灣南部
海域中的腸炎弧菌，並且進行一些基本特性分
析，進而由分析結果來評估腸炎弧菌在台灣南
部海域的分佈情形，而最後再來加以更深入的
探討。
研究架構
海水、有機樣本收集
(水質測量)
傳統方法培養
腸炎弧菌
利用腸炎弧菌ToxR基因專一性
引子進行最確數-聚合酵素連鎖
反應(MPN-PCR),偵測樣本中全
部的腸炎弧菌密度
數據整理與分析
利用PCR偵測樣本中
致病性腸炎弧菌(tdh/
trh)及分析KP和
血清型
採樣地點
安平漁港
興達漁港
前鎮漁港
採樣方法
•水樣:利用採樣筒丟入海水中採得水樣後放入
無菌塑膠試管中
•有機物質:刮取岸邊岩石上的藻類、貝類或水
中魚類後放入無菌塑膠試管中
•保存於室溫3小時內帶回實驗室分析
水質測量
•
•
•
•
•
•
•
•
PH (METTLER TOLEDO)
比重
鹽度
溫度 (VWR 1551-004)
透視度
濁度 (HACH 46500-00)
綜合水質DO、TDS、 EC (DR/2500 Prot HACH5900)
COD (HACH COD Reactor) 、 (HACH ODYSSEY)
Sample collection (3水樣3有機樣本)
APW
抽取DNA
每管APW各取1loop接種於TCBS
挑選典型綠色菌落分別各接種於TSB-2及TSA-2
PCR(toxR)
由TSB-2 抽取DNA
PCR (toxR)
toxR(+):
toxR(-):
PCR (tdh)
PCR (16S rRNA)
PCR (trh)
toxR(+)
致病性分析 生化鑑定
PCR (tdh) KP試驗
PCR (trh)
菌體抗原
toxR
• 對腸炎弧菌的專一性非
常強
•
L-GTCTTCTGACGCAATCGTTG
R-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG
•(JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Apr. 1999, p. 1173–1177)
TDH & TRH
•通常致病性腸炎弧菌都會具有的致病因子
• TDH:
L-GGTACTAAATGGCTGACATC
R-CCACTACCACTCTCATATGC
• TRH:
L-GGCTCAAAATGGTTAAGCG
R-CATTTCCGCTCTCATATGC
(Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2004, P.6401-6406)
16S rRNA
• 所有的菌都具有16s rRNA ,於是選擇保守的
序列來做為primer ,這樣就可知道樣本中的
DNA是否有毀損.
• L-ACGGCGCAGACTCCTACGGGAGGC
R-GGGTTGCGCTCGTTGCGGCACTTA
(Journal of Clinical Microbiology, Aug. 1994, P.1911-1917)
生化鑑定
試驗
正反應
斜面
黃色
紅色
－
底部
黃色
紅色
＋
產氣
斷裂
斷裂
－
硫化氫
黑色
非黑色
－
MTM
混濁狀
澄清狀
＋
革蘭氏染色
陽性
陰性
－
10μg
生長
不生長
＋
150μg
生長
不生長
－
Oixdase
深紫色
非深紫色
＋
ONPG
黃色
原色
－
Arginine
紫色
黃色
－
Lysine
紫色
黃色
＋
0%及10%Nacl
可生長
不生長或緩慢
－
6%及8%Nacl
可生長
不生長或緩慢
＋
42℃
混濁
澄清
＋
HLGB
黃色
紫色
＋
歐普氏
紅色
原色
－
TSI
O/129敏感性
腸炎弧菌的反應
負反應
Halophilism
KP
•使用 Wagatsuma agar 加以培養，若有 β
溶血 ( 在培養基上形成透明圈 ) 現象則稱為
Kanagawa phenomenon ( KP 陽性 )，很可能
就是致病菌株 .
命名系統
•
（一）方式：
西元年/月/地點/樣本編號/菌株編號
•
（二）說明：
西元年2005 →取後二碼 05
月份：01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12
地點：安平港→A
興達港→B
前鎮港→C
•
樣本編號 :
•
菌株編號：自01開始編號
•
例如 : 0508A1302
RESULTS
Table 1.安平港水質結果
水樣一
水樣二
水樣三
8
9
10
8
9
10
8
9
10
溫度 ( ℃)
31.56
29
30.1
30.29
29
30.1
31.86
29
30.1
濁度 (NTU)
9.07
2.79
4.45
8.45
2.82
4.04
4.45
2.74
2.77
比重
1.022
1.018
1.018
1.023
1.018
1.017
1.019
1.019
1.021
鹽度 (ppt)
35.61
29.02
29.42
34.79
29.02
28.07
31.58
30.37
33.46
28
19.2
15.6
25
14.2
13
23.1
22.4
22
PH (7.5-8.5)
7.62
7.93
7.12
8.38
7.93
7.76
7.58
7.94
7.85
DO (>5.0mg/l)
16.33
5.02
4.98
10.06
5.73
5.94
7.49
4.93
4.31
TDS (56 ms / cm)
66.6
61.66
58.32
71.14
60.98
56.46
60.66
61.42
69.7
EC 48,000uS ~
50,000uS(26
℃)
2
49198
49252
56825
48285
47155
52597
48866
58613
1650
1054
1430
1647
710
1563
1737
1036
1607
透視度 (15cm)
COD (mg/l)
Table 2.興達港水質結果
水樣一
水樣二
水樣三
8
9
10
8
9
10
8
9
10
28
30
31.1
28
30
30.8
28.5
30
30.8
濁度 (NTU)
20.6
2.92
5.72
6.81
2.81
2.29
1.7
1.17
1.84
比重
1.014
1.022
1.023
1.018
1.022
1.023
1.021
1.023
1.025
鹽度 (ppt)
23.26
34.79
36.55
28.62
34.79
36.55
33.04
36.13
39.23
透視度 (15cm)
17.2
25
26.8
23.3
23.8
21.2
27.2
26.6
10.8
PH (7.5-8.5)
6.89
7.84
8.02
7.41
7.91
7.83
7.08
7.89
7.94
DO (>5.0mg/l)
6.36
6.02
6.15
7.22
6.28
5.12
6.49
5.28
5.24
TDS (56 ms / cm)
45.28
67.1
70.74
56.22
67.92
74.8
63.44
73.32
74.2
35046
51086
59923
43238
51643
62429
48920
55932
61852
1384
1455
1536
1590
1605
1598
over
1346
1678
溫度 ( ℃)
EC 48,000uS ~
50,000uS(26℃)
COD (mg/l)
Table 3.前鎮港水質結果
水樣一
水樣二
水樣三
8
9
10
8
9
10
8
9
10
29
29
30.2
29
29
30.2
29
29
30.2
濁度 (NTU)
4.93
29
4.45
4.37
18.4
2.53
3.19
39.4
2.27
比重
1.022
1.024
1.025
1.021
1.024
1.023
1.021
1.024
1.024
鹽度 (ppt)
34.38
37.05
38.81
33.04
37.05
36.13
33.04
37.05
37.47
16
11
20.5
19.2
10
27.6
20.4
10.2
22
PH (7.5-8.5)
8.27
8.11
8.18
8.27
8.14
8.23
8.27
8.16
8.17
DO (>5.0mg/l)
5.34
4.99
7.44
5.17
6.66
6.34
4.61
5.89
6.3
TDS (56 ms / cm)
72.8
73.54
73.66
72.48
73.92
72.92
72.86
73.7
71.58
58467
56524
62761
58068
56673
61029
57814
56594
59572
over
1571
over
over
1168
over
over
1423
over
溫度 ( ℃)
透視度 (15cm)
EC 48,000uS ~
50,000uS(26℃)
COD (mg/l)
Fig 1. Amplification of the toxR gene by PCR
1
2
3
4
5
6
The primers amplified a 368bp
fragment
368bp
Lane1…….100bp marker
Lane2…….CCRC 10806
Lane3…….negative control
Lane4…….(+)sample
Lane5…….(-)sample
Lane6…….100bp marker
原液
10倍
100倍
1000倍
10ml原液
90ml緩衝液
90ml緩衝液
90ml緩衝液
每稀釋檢液各接種3支(稱三階三支），並於35~37℃，培養16~18小時
Table 4.判定為腸炎弧菌陽性者，利用最確數表（如附表），推算出腸炎弧
菌之最確數(MPN/g或MPN/ml )。
正反應試管數
正反應試管數
95%信賴界限
95%信賴界限
0.10mL
0.01mL
0.001mL
MPN/ml
(g)
0
0
0
<3.6
--
9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1,000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1,000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2,000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4,100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
--
下限
上限
0.10mL
0.01mL
0.001mL
MPN/ml
(g)
下限
上限
Table 5. Vibrio parabaemolyficus densities in different samples from three areas
Data
0508Awater1
0508Awater2
0508Awater3
0508Aorganics1
0508Aorganics2
0508Aorganics3
0508Bwater1
0508Bwater2
0508Bwater3
0508Borganics1
0508Borganics2
0508Borganics3
0508Cwater1
0508Cwater2
0508Cwater3
0508Corganics1
0508Corganics2
0508Corganics3
Temp.
pH
32
30
32
32
30
32
28
28
29
28
28
29
29
29
29
29
29
29
7.62
8.38
7.58
7.62
8.38
7.58
6.89
7.41
7.08
6.89
7.41
7.08
8.27
8.27
8.27
8.27
8.27
8.27
MPN (MPN/ml或g)
< 3.6
15
< 3.6
160
35
290
3.6
< 3.6
6.2
< 3.6
3.0
28
< 3.6
< 3.6
< 3.6
3.6
< 3.6
< 3.6
MPN-PCR(toxR) (MPN/ml或g)
< 3.6
93
< 3.6
> 1100
> 1100
> 1100
93
240
9.4
> 1100
> 1100
> 1100
3
< 3.6
< 3.6
460
> 1100
64
Table 6. Vibrio parabaemolyficus densities in different samples from three areas
Data
0509Awater1
0509Awater2
0509Awater3
0509Aorganics1
0509Aorganics2
0509Aorganics3
0509Bwater1
0509Bwater2
0509Bwater3
0509Borganics1
0509Borganics2
0509Borganics3
0509Cwater1
0509Cwater2
0509Cwater3
0509Corganics1
0509Corganics2
0509Corganics3
Temp.
pH
29
29
29
29
29
29
30
30
30
30
30
30
29
29
29
29
29
29
7.93
7.93
7.94
7.93
7.93
7.94
7.84
7.91
7.89
7.84
7.91
7.89
8.11
8.14
8.16
8.11
8.14
8.16
MPN (MPN/ml或g)
15
7.4
3.6
7.2
< 3.6
< 3.6
3.0
3.6
15
3.0
15
6.1
< 3.6
< 3.6
< 3.6
< 3.6
3.6
< 3.6
MPN-PCR(toxR) (MPN/ml或g)
9.2
9.2
23
> 1100
> 1100
> 1100
3.0
43
> 1100
1100
290
> 1100
3.6
< 3.6
< 3.6
3.6
23
23
Table 7. Vibrio parabaemolyficus densities in different samples from three areas
Data
0510Awater1
0510Awater2
0510Awater3
0510Aorganics1
0510Aorganics2
0510Aorganics3
0510Bwater1
0510Bwater2
0510Bwater3
0510Borganics1
0510Borganics2
0510Borganics3
0510Cwater1
0510Cwater2
0510Cwater3
0510Corganics1
0510Corganics2
0510Corganics3
Temp.
pH
30.1
30.1
30.1
30.1
30.1
30.1
31.1
30.8
30.8
31.1
30.8
30.8
30.2
30.2
30.2
30.2
30.2
30.2
7.12
7.76
7.85
7.12
7.76
7.85
8.02
7.83
7.94
8.02
7.83
7.94
8.18
8.23
8.17
8.17
8.23
8.17
MPN (MPN/ml或g)
3
3
9.2
7.4
<3.6
<3.6
9.2
6.1
9.2
3.0
15
6.2
<3.6
3.0
<3.6
<3.6
<3.6
<3.6
MPN-PCR(toxR) (MPN/ml或g)
93
>1100
36
>1100
9.2
>1100
93
>1100
43
>1100
93
>1100
<3.6
75
3.6
<3.6
23
23
Table 8. Detection of Vibrio parahaemolyticus from water and organic samples
Sample (n)
Water (n= 27)
V. parahaemolyticus detected by
Culture method
toxR-PCR
14 (51.9)
20 (74.1)
Organics (n = 27)
18 (66.7)
26 (96.3)
Total (n= 54)
32 (59.3)
46 (85.2)
Fig 2. Amplification of the 16S rRNA gene by
PCR
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
763bp
The primers amplified a 763bp fragment
Lane1…..marker
Lane3…..0508C33
Lane5…..0508C35
Lane7…..0508C45
Lane9…..0508C48
Lane11…no sample
Lane2…..0508C32
Lane4…..0508C34
Lane6…..0508C36
Lane8…..0508C47
Lane10….. negative control
Lane12…...no sample
Fig 3. tdh
Fig 4. trh
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
251bp
250bp
The primers amplified a 251bp fragment
Lane1……marker
Lane2……0508A41
Lane3…… 0508A42
Lane4……0508A43
Lane5……0508A44
Lane6……0508A45
Lane7……0508A46
Lane8……0508A47
Lane9……0508A48
Lane10….0508A49
Lane11……vp1
Lane12…negative control
The primers amplified a 250bp fragment
Lane1……marker
Lane3…… 0508A42
Lane5……0508A44
Lane7……0508A46
Lane9……0508A48
Lane11……vp2
Lane2……0508A41
Lane4……0508A43
Lane6……0508A45
Lane8……0508A47
Lane10….0508A49
Lane12…negative control
Fig 5. Amplification of the tdh gene by PCR
1 2 3
4 5 6
7 8 9 10 11 12
The primers amplified a 251bp
fragment
Lane1…..marker
Lane2…..0508B44
Lane3…..0508B45
Lane4…..0508B46
Lane5…..0508B47
Lane6…..0508B48
Lane7…..0508B49
300bp
Lane8…..0508B50
200bp
Lane9…..0508B51
Lane10…..0508B52
Lane11…..positive control
Lane12…..negative control
Fig 6. Amplification of the trh gene by PCR
The primers amplified a 250bp fragment.
1
2 3
4 5 6
7 8 9 10 11 12
Lane1…..marker
Lane2…..0508B53
Lane3…..0508B54
Lane4…..0508B55
Lane5…..0508B56
Lane6…..0508B57
Lane7…..0508B58
300bp
Lane8…..0508B59
200bp
Lane9…..0508B60
Lane10…0508B61
Lane11…..positive control
Lane12…..negative control
Table 9. Detection of haemolysin genes (tdh) from water and organic samples
tdh detected by
Sample (n)
Water (n= 27)
Culture method
0 (0)
tdh-PCR
0 (0)
Organics (n = 27)
0 (0)
4 (14.8)
Total (n= 54)
0 (0)
4 (7.4)
Table 10. Detection of haemolysin genes (trh) from water and organic samples
trh detected by
Sample (n)
Water (n= 27)
Culture method
0 (0)
trh-PCR
0 (0)
Organics (n = 27)
1 (3.7)
5 (27.8)
Total (n= 54)
1 (1.9)
5 (13.9)
Table 11. Serotyping of the 101 strains
isolated
血清型
數量
O1………………………………………………21
O2………………………………………………20
O3………………………………………………16
O4………………………………………………5
O5………………………………………………8
O6………………………………………………0
O7………………………………………………3
O8………………………………………………3
O9………………………………………………1
O10……………………………………………23
O11……………………………………………..1
Fig 7. percentage of serotyping from three areas
25
20
15
%
10
5
0
O1
O2
O3
O4
O5
O6
O7
serotyping
O8
O9
O10
O11
Conclusion
•研究中所發現的tdh(7.4)及trh(13.9)大多
是藉由MPN-PCR所發現(MPN只發現1.9%trh).
•在MPN與MPN-PCR兩者間比較的話,可以發現
藉由MPN-PCR所偵測到的腸炎弧菌數是較多
的.
•在三個採樣點中可以發現,其中前鎮港所分
離出的菌量都是很少量的,其次是安平港.
END
Thank for your attention