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ANTICUERPOS MONOCLONALES
HEMOCLASIFICADORES
Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc.
INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E
INMUNOLOGIA
SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE
MAYOR IMPORTANCIA CLÍNICA
ABO
RH
Sistema ABO
1901: Primer sistema descubierto por Karl
Landsteiner
Solo dos antígenos, A y B podían explicar
la existencia de 4 grupos: A,
B, AB, O
Pero los antígenos A y B son el resultado del funcionamiento
sinergístico de dos sistemas genéticos independientes:
El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19) crea una
enzima que funciona añadiendo azúcares a un
substrato precursor, antes de la acción de los genes A
y B (cromosama 9)
Sistema ABO
Antígeno H
Antígeno A
Antígeno B
Ceramida
Glucosa
Galactosa
N-acetilglucosamina
N-acetilgalactosamina
Fucosa
Sistema ABO
Eritrocitos
Genotipos
Suero
Fenotiposa Anticuerpos
Glucosiltransferasas
A1 A1 , A1 A2 , A1 O
A1
Anti-B
-3-N-acetilgalactosaminil
A2A2, A2O
A2
Anti-Bb
-3-N-acetilgalactosaminilc
BB, BO
B
Anti-A
-3-galactosil
A1B
A1 B
---
-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil
A2B
A2 B
---b
-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil
OO
O
Anti-A
y Anti-B
----
Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en
el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del
grupo A2 difieren en las propiedades cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.
Sistema ABO
Fenotipo A1
Fenotipo A2
A
H
Sistema ABO
Expresión antigénica:
Forma soluble (secretores) Saliva y todos los líquidos
corporales, excepto el LCR
Otras células sanguíneas
Linfocitos, plaquetas (adsobidos
del plasma).
Tejidos
En casi todas la cel epiteliales
(epitelio glandular) y sobre
células endoteliales. Amplia
distribución en tejidos
(Histo-sanguíneos)
Sistema ABO
Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1,
A1A2 y A1O: todos reaccionan igual con Anti-A.
Frecuencia de los grupos ABO en Cuba:
Grupo
A
%
A1
A2
8,26
variantes débiles
0,75
B
AB
O
27,67
36,68
11,2
A1B
2,28
A2B
0,81
49,03
Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997; 13(2): 124-131.
3,09
Sistema ABO
Características Generales de los Anticuerpos
ABO:
Alta importancia clínica.
Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los
individuos que no portan el antígeno en sus eritrocitos
(evento único en la serología de los grupos sanguíneos).
Se usan de forma habitual para la determinación de los
grupos sanguíneos (grupo reverso).
Son aglutininas frías usualmente clase IgM.
Activan el Complemento.
Causan hemólisis cuando son activos a 37 C (calientes).
Sistema ABO
Anticuerpos ABO:
Desarrollo con la edad:
 En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de
origen materno.
 Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase
IgM).
 Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de edad.
Epitopo D
exterior
membrana
interior
Proteína Rh
Cadena lateral
Banda 3 transportador de aniones
Cadena lateral
Banda 4 transportador de glucosa
Sistema Rh
Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner.
Después del ABO, el más importante en la
clínica:
Anti-Rh causa reacción transfusional hemolítica
Incompatibilidad madre-hijo: enfermedad
hemolítica del feto y del recien nacido.
Se han descrito hasta 52 antígenos.
Antígeno D: define condición de POSITIVO.
Otros antígenos: C,c,E,e,d.
 Antígeno D: mosaico antigénico, determinado por epitopos.
Sistema Rh
Cromosoma: 1p36.13-p34.3
Nombre de genes: RHD, RHCE
Nombre del producto de los genes: polipéptido RhD,
polipéptido RhCE.
No. de exones: RHD 10, RHCE 10.
Expresión:
Eritrocitos de sangre de cordón.
No formas solubles.
Tejidos:
Específicos de la línea
eritroide.
Sistema Rh
•El polimorfismo del RhD es único.
•La mayoría de los que portan el gen D, tienen un
polipéptido D completo.
•Pero existen variantes débiles, por expresión
disminuída o incompleta.
Anticuerpos vs. Rh(D):
. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su
origen (no naturales).
Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.
Pocas veces fijan Complemento
Aparecen en individuos D negativos o en D parciales
Producción de reactivos hemoclasificadores
basados en sueros humanos policlonales:
Cada lote es una mezcla diferente de moléculas
obtenidas de distintos donantes.
Cada lote se comporta de forma diferente frente a las
expresiones débiles del Ag.
Hay diferente avidez.
Pueden presentar poli aglutinación frente al antígeno
críptico Tn.
 Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para
corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B.
Se requieren técnicas manuales bien realizadas.
Generación de
hibridomas:
Ventajas de los Reactivos basados en AcM:
Cada reactivo monoclonal es:
Una aglutinina directa.
Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA
o IgG).
De sólo una especificidad epitópica.
De sólo una avidez
No contiene Ac contaminantes.
Producción de los AcM:
Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generación
de hibridomas, clonajes y caracterización de las líneas
célulares.
Más simple en la etapa de producción a gran escala.
Cada reactivo puede ser:
Un único AcM
Una mezcla de AcM
Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas.,
para que funcionen mejor en los distintos métodos de
hemaglutinación.
Especificaciones para garantizar la calidad
de los reactivos hemoclasificadores basados
en AcM:
Establecer la concentración o titulo de AcM y condiciones de la
solución amortiguadora (pH, conc. Salina).
Clonaje celular por 3 veces, garantía de la monoclonalidad.
Crear bancos de células semilla Maestros y de Trabajo.
Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma
congelado. Cultivar y expandir las células mediante pases seriados
por no mas de 3 meses. Después de este tiempo: desechar los
cultivos.
Errores que se deben evitar:
1.
AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos B(A) o A(B):
cantidades muy pequeñas del antígeno contrario presentes
normalmente en algunos individuos. Solución: diluir los AcM.
2.
Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino
una estructura estérica muy similar, que produce alta reacción). Se
adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades
reumáticas, etc. Solución: formular el reactivo en pH alcalino.
3.
Algunos AcM producen reacción en monocapa en tubos y
microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos con Tween.
Añadir albúmina o gelatina a la formulación en un bajo %
(albúmina como máximo 3%, gelatina como máximo 1%). Mejor:
albúmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.
Problemas para la obtención del anti-D
monoclonal:
Mosaico D:
Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos.
Cada AcM detecta un solo epítopo.
No todas las células D+ expresan todos los epítopos de D.
Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en eritrocitos.
 Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-D
detecta a todas las variantes, todos dejan algo.
El problema es escoger al que detecta a los mas importantes
epítopos para una correcta clasificación.
Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de
D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben
transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.
Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: imposible
obtener monoclonales murinos anti-D.
Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco
aglutinantes): se debe seleccionar moléculas IgG3: molécula
mas abierta mejor aglutinante.
Producción de AcM anti-D humanos:
Sangre de
donantes
inmunizados
Leucocitos + VEB
AcM Anti-D
IgG - IgM
Línea celular B transformada + / fusión
Clonajes
Reglas de Oro de la Calidad en reactivos
hemoclasificadores:
Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.
La especificidad, potencia, y avidez dependen de
la concentración.
Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej.
Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón.
Garantía del pH final del producto: rango general
6.5-7.2.
Se adiciona HEPES cuando se cosechan los
sobrenadantes.
Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad
del reactivo.
ADITIVOS:
EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no
lavados. También previene la degradación por proteolisis
Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen
monocapa con eritrocitos.
Colorantes: Coloración intensa puede afectar resultados en
microplacas.
Control de Calidad:
Chequeo sistemático para demostrar
correctamente en la producción:
que
todo
se
hizo
Pruebas:
Especificidad
Reacción completa: 4+
Potencia: A o B
1/64 con fenotipos fuertes A1 o B
Titulación con 2% de SAB
1/8-16 con fenotipos débiles: A2B
o A1B
para mantener la conc. de
proteínas mientras se diluye.
Avidez:
según protocolo 5-10 segundos.
Adicional: medir concentración de azida, conc. proteínas, pH y
fuerza iónica.
Métodos de Producción:
En animales de experimentación: Liquido ascítico murino (LAM).
Ej. Anti-A, Anti-B.
En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el antiD.(Mejores que los tanques agitados para la concentración de Ac).
Chequear niveles de glucosa en el medio.
Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio
extracapilar (las células y el SBF deben estar en el EE, mientras el
medio se bombea al espacio intracapilar.
La estabilidad de las líneas celulares mejora con los reclonajes.
NUEVAS TECNOLOGIAS:
Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de
anticuerpos.
Nos vemos en Hematología Habana 2005!!
Mayo 16-20, 2005
4to Congreso de la
Sociedad Cubana de
Hematología