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ANTICUERPOS MONOCLONALES
HEMOCLASIFICADORES
Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc.
INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E
INMUNOLOGIA
SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE
MAYOR IMPORTANCIA CLÍNICA
ABO
RH
Sistema ABO
1901: Primer sistema descubierto por Karl
Landsteiner
Solo dos antígenos, A y B podían explicar
la existencia de 4 grupos: A,
B, AB, O
Pero los antígenos A y B son el resultado del funcionamiento
sinergístico de dos sistemas genéticos independientes:
El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19) crea una
enzima que funciona añadiendo azúcares a un
substrato precursor, antes de la acción de los genes A
y B (cromosama 9)
Sistema ABO
Antígeno H
Antígeno A
Antígeno B
Ceramida
Glucosa
Galactosa
N-acetilglucosamina
N-acetilgalactosamina
Fucosa
Sistema ABO
Eritrocitos
Genotipos
Suero
Fenotiposa Anticuerpos
Glucosiltransferasas
A1 A1 , A1 A2 , A1 O
A1
Anti-B
-3-N-acetilgalactosaminil
A2A2, A2O
A2
Anti-Bb
-3-N-acetilgalactosaminilc
BB, BO
B
Anti-A
-3-galactosil
A1B
A1 B
---
-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil
A2B
A2 B
---b
-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil
OO
O
Anti-A
y Anti-B
----
Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en
el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del
grupo A2 difieren en las propiedades cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.
Sistema ABO
Fenotipo A1
Fenotipo A2
A
H
Sistema ABO
Expresión antigénica:
Forma soluble (secretores) Saliva y todos los líquidos
corporales, excepto el LCR
Otras células sanguíneas
Linfocitos, plaquetas (adsobidos
del plasma).
Tejidos
En casi todas la cel epiteliales
(epitelio glandular) y sobre
células endoteliales. Amplia
distribución en tejidos
(Histo-sanguíneos)
Sistema ABO
Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1,
A1A2 y A1O: todos reaccionan igual con Anti-A.
Frecuencia de los grupos ABO en Cuba:
Grupo
A
%
A1
A2
8,26
variantes débiles
0,75
B
AB
O
27,67
36,68
11,2
A1B
2,28
A2B
0,81
49,03
Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997; 13(2): 124-131.
3,09
Sistema ABO
Características Generales de los Anticuerpos
ABO:
Alta importancia clínica.
Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los
individuos que no portan el antígeno en sus eritrocitos
(evento único en la serología de los grupos sanguíneos).
Se usan de forma habitual para la determinación de los
grupos sanguíneos (grupo reverso).
Son aglutininas frías usualmente clase IgM.
Activan el Complemento.
Causan hemólisis cuando son activos a 37 C (calientes).
Sistema ABO
Anticuerpos ABO:
Desarrollo con la edad:
En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de
origen materno.
Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase
IgM).
Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de edad.
Epitopo D
exterior
membrana
interior
Proteína Rh
Cadena lateral
Banda 3 transportador de aniones
Cadena lateral
Banda 4 transportador de glucosa
Sistema Rh
Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner.
Después del ABO, el más importante en la
clínica:
Anti-Rh causa reacción transfusional hemolítica
Incompatibilidad madre-hijo: enfermedad
hemolítica del feto y del recien nacido.
Se han descrito hasta 52 antígenos.
Antígeno D: define condición de POSITIVO.
Otros antígenos: C,c,E,e,d.
Antígeno D: mosaico antigénico, determinado por epitopos.
Sistema Rh
Cromosoma: 1p36.13-p34.3
Nombre de genes: RHD, RHCE
Nombre del producto de los genes: polipéptido RhD,
polipéptido RhCE.
No. de exones: RHD 10, RHCE 10.
Expresión:
Eritrocitos de sangre de cordón.
No formas solubles.
Tejidos:
Específicos de la línea
eritroide.
Sistema Rh
•El polimorfismo del RhD es único.
•La mayoría de los que portan el gen D, tienen un
polipéptido D completo.
•Pero existen variantes débiles, por expresión
disminuída o incompleta.
Anticuerpos vs. Rh(D):
. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su
origen (no naturales).
Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.
Pocas veces fijan Complemento
Aparecen en individuos D negativos o en D parciales
Producción de reactivos hemoclasificadores
basados en sueros humanos policlonales:
Cada lote es una mezcla diferente de moléculas
obtenidas de distintos donantes.
Cada lote se comporta de forma diferente frente a las
expresiones débiles del Ag.
Hay diferente avidez.
Pueden presentar poli aglutinación frente al antígeno
críptico Tn.
Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para
corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B.
Se requieren técnicas manuales bien realizadas.
Generación de
hibridomas:
Ventajas de los Reactivos basados en AcM:
Cada reactivo monoclonal es:
Una aglutinina directa.
Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA
o IgG).
De sólo una especificidad epitópica.
De sólo una avidez
No contiene Ac contaminantes.
Producción de los AcM:
Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generación
de hibridomas, clonajes y caracterización de las líneas
célulares.
Más simple en la etapa de producción a gran escala.
Cada reactivo puede ser:
Un único AcM
Una mezcla de AcM
Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas.,
para que funcionen mejor en los distintos métodos de
hemaglutinación.
Especificaciones para garantizar la calidad
de los reactivos hemoclasificadores basados
en AcM:
Establecer la concentración o titulo de AcM y condiciones de la
solución amortiguadora (pH, conc. Salina).
Clonaje celular por 3 veces, garantía de la monoclonalidad.
Crear bancos de células semilla Maestros y de Trabajo.
Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma
congelado. Cultivar y expandir las células mediante pases seriados
por no mas de 3 meses. Después de este tiempo: desechar los
cultivos.
Errores que se deben evitar:
1.
AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos B(A) o A(B):
cantidades muy pequeñas del antígeno contrario presentes
normalmente en algunos individuos. Solución: diluir los AcM.
2.
Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino
una estructura estérica muy similar, que produce alta reacción). Se
adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades
reumáticas, etc. Solución: formular el reactivo en pH alcalino.
3.
Algunos AcM producen reacción en monocapa en tubos y
microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos con Tween.
Añadir albúmina o gelatina a la formulación en un bajo %
(albúmina como máximo 3%, gelatina como máximo 1%). Mejor:
albúmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.
Problemas para la obtención del anti-D
monoclonal:
Mosaico D:
Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos.
Cada AcM detecta un solo epítopo.
No todas las células D+ expresan todos los epítopos de D.
Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en eritrocitos.
Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-D
detecta a todas las variantes, todos dejan algo.
El problema es escoger al que detecta a los mas importantes
epítopos para una correcta clasificación.
Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de
D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben
transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.
Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: imposible
obtener monoclonales murinos anti-D.
Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco
aglutinantes): se debe seleccionar moléculas IgG3: molécula
mas abierta mejor aglutinante.
Producción de AcM anti-D humanos:
Sangre de
donantes
inmunizados
Leucocitos + VEB
AcM Anti-D
IgG - IgM
Línea celular B transformada + / fusión
Clonajes
Reglas de Oro de la Calidad en reactivos
hemoclasificadores:
Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.
La especificidad, potencia, y avidez dependen de
la concentración.
Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej.
Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón.
Garantía del pH final del producto: rango general
6.5-7.2.
Se adiciona HEPES cuando se cosechan los
sobrenadantes.
Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad
del reactivo.
ADITIVOS:
EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no
lavados. También previene la degradación por proteolisis
Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen
monocapa con eritrocitos.
Colorantes: Coloración intensa puede afectar resultados en
microplacas.
Control de Calidad:
Chequeo sistemático para demostrar
correctamente en la producción:
que
todo
se
hizo
Pruebas:
Especificidad
Reacción completa: 4+
Potencia: A o B
1/64 con fenotipos fuertes A1 o B
Titulación con 2% de SAB
1/8-16 con fenotipos débiles: A2B
o A1B
para mantener la conc. de
proteínas mientras se diluye.
Avidez:
según protocolo 5-10 segundos.
Adicional: medir concentración de azida, conc. proteínas, pH y
fuerza iónica.
Métodos de Producción:
En animales de experimentación: Liquido ascítico murino (LAM).
Ej. Anti-A, Anti-B.
En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el antiD.(Mejores que los tanques agitados para la concentración de Ac).
Chequear niveles de glucosa en el medio.
Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio
extracapilar (las células y el SBF deben estar en el EE, mientras el
medio se bombea al espacio intracapilar.
La estabilidad de las líneas celulares mejora con los reclonajes.
NUEVAS TECNOLOGIAS:
Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de
anticuerpos.
Nos vemos en Hematología Habana 2005!!
Mayo 16-20, 2005
4to Congreso de la
Sociedad Cubana de
Hematología