Transcript 不同迴流流速操作條件下厭氧氨氧化反 應效能與菌相變化之研究

不同迴流流速操作條件下厭氧氨氧化反
應效能與菌相變化之研究
摘要
• 厭氧氨氧化反應(Anammox, Anaerobic Ammonia
Oxidation)為將氨氮(NH4+)及亞硝酸氮(NO2-)直接反應生
成氮氣(N2)。此反應具有不需添加碳源與曝氣、污泥產量
低等諸多優點。由於操作條件如反應槽上升流速等對於系
統效能有直接之影響，因此本研究設計厭氧氨氧化批次反
應槽，控制不同的污泥迴流流速，分別為0 ml/min、10
ml/min、100 ml/min，利用可區分菌種活性之藥品
Propidiummonoazide (PMA)和聚合酶鏈鎖反應-變性梯度
凝膠電泳(PCR-DGGE)等分子生物技術以及水質分析方法，
探討不同污泥迴流流速條件下其系統具活性之厭氧氨氧化
菌群結構變化和除氮效能間的關係。
一、 前言
• 由於都市快速發展，使得部分工業廢水、家庭廢水未經適當
處理即排入天然水域中，導致環境中氨氮濃度逐漸增加，可
能會降低水中溶氧及影響水質的安全衛生，進一步對原有的
自然環境生態造成破壞，故近年來國內環保單位正討論並草
擬更嚴格的放流水標準以保護生態平衡。目前有許多研究以
發展出多種去除含氮污染物的處理程序，其中的生物處理法
仍是處理含氨氮廢污水最經濟的方法之一。
• 近年研究發現，特殊的自營性微生物可於無氧環境下，利用
二氧化碳(CO2)作為碳源，將氨氮(NH4+)與亞硝酸根離子
(NO2-)反應直接轉化生成氮氣(N2)(Jettenet al., 2001) ，此
除氮機制即所謂的厭氧氨氧化反應(Anaerobic
AmmoniaOxidation, Anammox)，其化學方程式為NH4+ +
NO2- →N2 + 2H2O。此程序有別於一般傳統硝化結合脫硝
程序系統，具有不需添加碳源、污泥產量低以及不需額外曝
氣節省能源消耗等諸多優點；此外，其應用範圍廣泛，包含
工業製程廢水、畜牧業廢水以及掩埋場滲出水等。
近年來諸位學者利用Ethidium monoazide (EMA)或Propidium
monoazide(PMA)區分環境樣本的菌群存活與否，過去的研究中
有學者針對EMA 與PMA進行比較與探討，由結果發現EMA 對
於活菌具有毒性但PMA 則否(Pan et al.,2007)；此外，PMA 對
於生物膜的通透性較佳，因此對於菌種的專一性較強(Nocker
et al., 2006；Flekna et al., 2007；Cawthorn and Witthuhn,
2008)。過去有學者利用Propidium monoazide (PMA)藥品區分
環境樣本中菌種之死活，並透過分子生物技術PCR-DGGE，探
討微生物組成（Nocker et al., 2006）。但目前相關文獻鮮少探
討具活性的厭氧氨氧化菌種之定性分析，因此無法釐清真正存
活於系統中的厭氧氨氧化菌群，若能建立區分厭氧氨氧化菌種
存活與否的分析方法，將有助於厭氧
氨氧化系統穩定與功能提升。
二、 實驗材料與方法
• 1. 樣本來源
本研究取自於工業技術研究院所架設不同污泥迴流流速之厭氧
氨氧化系統中污泥樣本。取適量之污泥以10000rpm 離心1 分鐘
以收集污泥沉澱物(pellet)並去除上澄液，利用1×PBS 再懸浮並
以10000rpm 離心1 分鐘，重複上述步驟以清洗pellet。
• 2. Propidium Monoazide (PMA)處理
將PMA 溶於20 % dimethyl sulfoxide，濃度配置為20 mM，
將2.5 μL PMA加入500 μL 的樣本並放置於暗處5 min，之後將樣
本置於冰上並開啟650W 的鹵素燈照射樣本2~4 min，再以
10000rpm 離心2 分鐘(Nocker et al., 2009)。
• 3. DNA 萃取及聚合酶鏈鎖反應
將樣本利用商用試劑UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit (Mo
Bio, USA)進行DNA 萃取。將萃取後之DNA 進行PCR 增幅，本
研究將使用之引子為針對厭氧氨氧化菌之PLA46f 及Amx368r 與
針對氨氧化菌之amoA gene 引子對(1F vs2R)，其相關實驗條件
如文獻所示(Neef et al., 1998；Schmid et al., 2003)以及
(Rotthauwe et al., 1997)。將PCR 增幅後之產物，利用1.5%之
瓊脂膠糖明膠進行電泳(Agarose gel)分析，再以Safe ViewerTM
Nucleic Acid Stain 染色30 分鐘並以紫外光顯像。
• 4. 變性梯度凝膠電泳分析及DNA 純化
本研究使用之DGGE 膠體為6 % (wt/vol) acrylamide/bis，變
性梯度範圍為30% ~ 55 %分析以PCR 所增幅針對Anammox 族
群之產物。利用變性梯度凝膠電泳槽(Dcode gene System, BioRad)，以80 伏特電壓及60 ℃條件下進行電泳12 小時，最後利用
Safe ViewerTM Nucleic Acid Stain 進行核酸染色，並以紫外光
顯像。PCR-DGGE 分析後，將膠體上相異的亮帶分別切下後置
於無菌水中，經過冷凍-解凍過程獲取目標DNA 片段；並重複進
行PCR-DGGE 與切膠純化的分析直至確定為單一亮帶為止。
• 5. 水質分析
系統水質監測部份，由工研院每週監測進出流水之NH4+-N、
NO2--N、與NO3--N ， 其分析方式為利用離子層析儀（ Ion
Chromatography, IC ， 型號DioNEX-DX100，陰離子分析管柱
AS-4A，流洗液為NaCO3 與NaHCO3；陽離子分析管柱CS-15、
流洗液為H2SO4）。
三、 結果與討論
• 1. Propidium monoazide (PMA)與厭氧氨氧化族群之分析方法本
研究先以系統污泥經過處理(放置於100 ℃水浴中30 min 並加入
70 %酒精反應30 min)與未處理後分別添加PMA 進行測試，並以
針對厭氧氨氧化菌之專一性引子對PLA46 和AMX368 分析系統
中污泥樣本(如表1)，利用agarose gel確定產物長度為377 bp(如
圖1 所示)。由分析結果發現經馴化後的樣本有明顯亮帶，代表系
統中確實存在厭氧氨氧化菌，並正確的增幅其目標片段。此外，
由結果亦發現經過高溫與酒精處理後之馴養污泥添加PMA 後，
其增幅之亮帶並未十分明顯，亦證明PMA 可與死亡菌種之DNA
結合，因此無法藉由PCR 增幅放大，故DGGE 圖譜中(圖2)亮帶
並不明顯，由此結果得知，PMA 方法確實可以用來進行厭氧氨
氧化菌群之存活與否作判別。
• 2. 批次厭氧氨氧化系統菌相變化與除氮效能之分析本實驗原始污
泥來自於生物除氮系統馴養後之污泥，植種於低溶氧濃度的
UASB 反應槽，所使用之基質採氨氮與亞硝酸鹽以約一比一之濃
度進流，不添加額外碳源，以三種不同的污泥迴流流速馴養厭氧
氨氧化菌，嘗試探討最佳的污泥迴流流速，作為提供日後實廠操
作所需之重要參數。分別採集操作初期(反應槽操作56 天)、操作
穩定(反應槽操作115 天)等不同時期污泥樣本，以DGGE 進行微
生物族群分析，並探討菌相消長與系統中除氮效能間關係。
• (1) 污泥迴流流速為0ml/min
當污泥迴流流速為0ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除
率不盡理想。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為70 mg/L，
經12 小時反應後，出流濃度僅去除至50 mg/L，去除率約為30
%；亞硝酸氮部分，進流濃度約為180 mg/L，出流濃度僅減低至
150 mg/L，去除效率約為20 %；硝酸氮部分僅增加0.1 mg/L；
而氮氣部分約增加44 ml(如圖3)，此系統中氨氮及亞硝酸鹽去除
率不佳，未有硝酸鹽的累積，但有大量的氮氣產生。
• 污泥迴流流速為0ml/min 時之族群分析如圖4 所示，由結果中得
知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia
anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus
Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統
中。系統中氨氮與亞硝酸鹽去除不佳，推測可能因為厭氧氨氧化
菌無法與基質充分混合均勻，導致部份菌群死亡，釋放至反應槽
中COD 之濃度高達97 mg/L，因此可能存在異營脫硝菌與厭氧氨
氧化菌競爭，消耗系統中的亞硝酸鹽與硝酸鹽，並增加氮氣的產
量；此外，由於異營菌生長快速，可能會取代厭氧氨氧化菌成為
系統中的優勢菌種，導致除氮效果不良。因此未來建立厭氧氨氧
化反應槽時，應定期監測系統中之碳氮比，避免造成異營性微生
物成為系統中的優勢菌種。
• (2) 污泥迴流流速為10ml/min
當污泥迴流流速為10 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去
除率十分良好。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為
60mg/L，出流濃度去除至0 mg/L，去除率約為100 %；亞硝酸氮
部分，進流濃度約為120 mg/L，出流濃度僅減低至3 mg/L，去除
效率約為97 %，而硝酸氮部分，增加約為30 mg/L；而氮氣部分
約增加38 ml(如圖5)。此系統即可在12 小時內幾乎將氨氮與亞硝
酸氮完全去除，除氮能力十分良好，且有少量硝酸氮之累積與氮
氣之產生，十分符合典型的厭氧氨氧化反應。
• 污泥迴流流速為10ml/min 時之族群分析如圖6 所示，由結果中得
知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia
anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus
Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統
中。此系統的除氮效率極佳，推測系統中的厭氧氨氧化菌能充分
與基質混合，並且保持污泥結構緊密，使氨氮與亞硝酸鹽的去除
效率最好，因此未來實場若操作厭氧氨氧化系統時，建議可採用
較低的污泥迴流流速(如流速為10 ml/min)，做為反應槽設計參數
之一。
• (3) 污泥迴流流速為100ml/min
當污泥迴流流速為100 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮
去除率較差。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為50 mg/L，
經12 小時反應後，出流濃度去除至13 mg/L，去除率約為74 %；
亞硝酸氮部分，進流濃度約為130 mg/L，出流濃度減低至45
mg/L，去除效率約為 65 %，而硝酸鹽氮部分，增加約為
30mg/L；而氮氣部分約增加1 ml(如圖7)。氨氮與亞硝酸氮去除
率較低，累積較多的硝酸鹽，但僅產生微量的氮氣；此外，亦
發現此系統中的ORP 均高於200 mV且溶氧均高於2 mg/L。而
當系統操作120 天後水中pH 逐漸降低於7 以下且累積於系統的
硝酸鹽濃度大幅上升，因此在150 天更換基質時於系統內沖提
氮氣，使ORP 小於50 mV 讓環境為無氧狀態，由水質數據發現，
系統中的氨氮與亞硝酸鹽幾乎沒有去除，且系統操作169 天後，
由針對氨氧化菌的agarose gel 圖譜中(如圖8)發現，此時系統
中 的 氨 氧 化 菌 喪 失 其 活 性 。
• 污泥迴流流速為100ml/min 時之族群分析如圖9 所示，由結果中
得知此時系統中存在有厭氧氨氧化菌 Candidatus Brocadia
anammoxidans 、CandidatusBrocadia sp.、Candidatus
Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統
中。過去文獻指出在高剪力的環境下，會導致厭氧氨氧化顆粒污
泥破碎，而造成厭氧氨氧化菌活性降低(Arrojo et al., 2008)，因
此推測操作於高流速的環境，可能會降低厭氧氨氧化菌的活性；
此外，系統中溶氧與ORP 過高將導致硝化菌大量生長，可能取
代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種。因此未來操作厭氧氨氧
化系統，應避免流速過快而造成厭氧氨氧化菌活性降低之現象。
• 表.
• 圖.
•
四、 結論
1. 污泥迴流流速為0 ml/min 時，推測厭氧氨氧化菌可能無法與基
質充分混合， 而導致部份菌群死亡， 增加系統中COD 之濃度，
可能造成異營菌與厭氧氨氧化菌競爭， 影響整體的除氮效率。
2. 污泥迴流流速為10 ml/min 時， 推測厭氧氨氧化菌與基質均勻混
合，並保持污泥結構緊密， 使總氮去除率十分良好。
3. 污泥迴流流速為100 ml/min 時， 推測操作於高流速的環境，可
能會降低厭氧氨氧化菌的活性；此外，系統中溶氧與ORP 過高
將導致硝化菌大量生長，可能取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優
勢菌種。
4. 未來操作厭氧氨氧化系統，應避免流速過快而造成厭氧氨氧化菌
活性降低， 建議可採用低迴流流速10 ml/min 作為反應槽設計參
數之一； 此外， 應定期監測系統中碳氮比， 避免異營性微生物
成為系統中優勢菌種。