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5.
NUCLEOSOMI
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Le dimensioni dell’acido nucleico è molto maggiore
delle dimensioni del compartimento in cui è contenuto
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Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 – 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 109 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi Compattamento del DNA nei cromosomi a) 
b) 
c) 
d) 
e) 
contenimento nel ristretto spazio cellulare (o virale) protezione da possibili danni maggiore stabilità per una corretta espressione dell’informazione Efficiente trasmissione alle cellule figlie organizzazione strutturale di ordine superiore: facilita l’espressione genica e la ricombinazione omologa, che genera la diversità individuale DNA + proteine (> parte istoni) = cromatina 2
DNA viene compattato di ≈ 10.000 volte (da cm a μm) Diversi stadi 1) associazione DNA-­‐istoni => nucleosoma 2) associazione fra nucleosomi vicini Compattamento < accessibilità per le proteine < metabolismo del DNA. Le molecole di DNA sono fortemente compattate Vi sono 3 livelli di ripiegamento: 1.  Nucleosomi (11 nm) 2.  Filamenti da 30 nm 3.  Anse radiali. 3
Nucleosoma: Unità d’impacchettamento della cromatina ISTONI 5 tipi: H2A, H2B, H3, H4 (core del nucleosoma) H1 (lega il DNA linker fra 2 nucleosomi) proteine basiche, cioè cariche positivamente (> 20% di lisina e arginina) PM 11-­‐15 KDa (H1 è 20 kDa) 4
Figura 4.18 Proteine istoniche. 5
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I singoli nucleosomi possono essere ottenuti trattando la cromatina con ENDONUCLEASI MICROCOCCICA (Mnasi): taglia il DNA alla giunzione tra i nucleosomi Figura 4.16A Diges=one con nucleasi micrococcica del DNA nucleosomico. 7
Figura 4.16B Diges=one con nucleasi micrococcica del DNA nucleosomico. Frazionamento su gradiente di saccarosio si genera una scaletta: + del 95 % del DNA viene recuperato sotto forma della scala da 200 bp nel nucleo c’è poco DNA libero tra un istone e l’altro. 8
Figura 4.19 La formazione del nucleosoma è un processo ordinato. H32*H42
Nocciolo centrale
1 dimero H2A*H2B
Visibile dall’alto
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+
Tramite le loro cariche gli istoni si legano alla porzione zucchero-­‐fosfato del DNA carico -­‐ 10
Tutti e 4 gli istoni del nucleo stabiliscono contatti con il DNA: RIPIEGAMENTO ISTONICO Il DNA ricco in AT ha tendenza a curvarsi
meglio in direzione del solco minore
Invece le sequenza ricche in GC tendono a
esporre il solco minore verso l’esterno
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Figura 4.20 Code N-­‐terminali degli istoni. Le code N-­‐terminali degli istoni sono modificate Transitorie ma in grado di cambiare le proprietà funzionali degli ottameri 12
La replicazione separa i filamenti di DNA, quindi deve distruggere il nucleosoma, ma i nucleosomi si riformano immediatamente 1 2 In che modo gli istoni si associano al DNA per generare i nucleosomi? 2 vie 13
Non avviene
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L’assemblaggio dei nucleosomi non è un processo spontaneo ma richiede l’intervento di fattori che trasportano gli istoni sul DNA : i trasportatori degli Istoni: CAF, RCAF o NAP-­‐1 15
da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm fibra da 10-­‐11 nm E’ una fila continua di nucleosomi. • Si ottiene in condizioni di bassa forza ionica e non necessita della presenza dell’istone H1. 16
COME MODIFICARE LA STRUTTURA DELLA CROMATINA
Varianti istoniche H2A.z lievito: a)  richiesto per l’espressione di circa 200 geni b)  limita l’espansione dell’eterocromatina costituita dal complesso SIR mammifero: promuove la formazione dell’eterocromatina (altera la superficie del nucleosoma per promuovere il folding mediato da HP1a-­‐ Fan J.Y. 2004) Drosophila: si localizza sull’eterocromatina e promuove il silenziamento genico 17
CENP-­‐A sostituisce H3 nei centromeri Posizionamento dei nucleosomi
Lungo una sequenza di DNA i nucleosomi si posizionano in punti specifici o casualmente ? 18
Esperimento Marcatura indiretta
dell’estremità
Enzima di restrizione taglia in corrispondenza di un sito bersaglio (rosso) e nucleasi in corrispondenza delle giunzioni tra nucleosomi (verde) NUCLEOSOMA
OCCUPA SEQUENZA
BEN DEFINITA
DI DNA
NON C’è
POSIZIONAMENTO
DEI NUCLEOSOMI
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Competizione tra gli istoni e le proteine sequenze specifiche Il posizionamento influisce sulla
accessibilità al DNA
Il nucleosoma richiede almeno 146 bp per formarsi Alcune proteine legano il nucleosoma e ne condizionano il posizionamento 20
Il Posizionamento dei nucleosomi presenta risvolti importanti per quanto riguarda la trascrizione genica Posizionamento Traslazionale 21
Posizionamento rotazionale Modello che descrive la possibilità di accesso al DNA nucleosomico
L’accessibilità al DNA dipende dalla sua localizzazione nel nucleosoma 22
da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm
Il ruolo dell’istone H1
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Cromatosoma C
N
H1
H3
H3
1 mM 5 mM Zhou et al Nature 395,1998
Leuba et al PNAS 1998
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Le funzioni dell’istone H1: •  Stabilizzare la fibra da 30 nm (punto ancora controverso); •  Minimizzare lo slittamento nucleosomale; •  Cambia la ripetizione nucleosomale; •  Effetti sull’attività trascrizionale. Modello folding-­‐unfolding della cromatina e ruolo di H1 “Collana di perle” Nucleosomi aggregati 20nm 30nm Hizume K. Et al. (2005) Biochemistry 44, 12978-­‐12989 26
L’aggiunta di H1 stabilizza una struttura cromatinica di ordine superione: fibra da 30 nm i) modello a soleneoide ii) modello a zig-­‐zag Modelli a
zigzag della
cromatina
Irregolarità della fibra di 30 nm
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Modello di come l’istone H1 potrebbe modificare il DNA che esce dal nucleosoma Modello per le code degli istoni nella formazione della fibra 30 nm fibra da 30 nm
• La fibra si avvolge su se stessa, con una periodicità di 6 nucleosomi per ogni giro, che corrisponde ad un rapporto di condensazione di 40 28
L’impaccamento della cromatina sui nucleosomi: 6 volte: da 1 m a 16 cm nelle fibre da 30 nm: 40 volte: 1 m a 2.5 cm molto lontano dall’impaccamento necessario (10.000-­‐100.000 volte) per contenere il DNA nel nucleo. Strutture di ordine superiore della cromatina formazione di anse (40-­‐90 kbp) bloccate alla base da una struttura proteica denominata scaffold nucleare 29
Strutture di ordine superiore 30
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5 avvolgimenti della doppia elica
La compressione del DNA avviene a più livelli nucleosoma fibra da 30 nm fibra ad ansa fibra da 700 nm :cromatina si superavvolge (diametro dei singoli cromatidi) fibra da 1400 nm: livello di condensazione massimo (cromosomi mitotici) 33