Transcript Wim Reybroeck

ILVO
ANTIBIOTICA IN MELK EN
HONING: EEN UPDATE
Dr. Wim Reybroeck
VMT FOOD - Symposium Antibiotica en
Resistentie in de Voedselketen
Bunnik, NL, 18 februari 2016
ILVO
INLEIDING
Screeningstesten worden massaal ingezet bij de controle van
melk op antibioticaresiduen, dit volgens een bepaalde strategie
LCMS/MS
bevestiging
(identificatie en kwantificatie)
HPLC
ELISA
RECEPTOR TEST
groepsspecificatie
MICROBIOL. + ENZYM
RECEPTOR TEST - ELISA
MICROBIOLOGISCH
screening
Besluit vaak enkel gebaseerd op een screeningsresultaat
ILVO
DETECTIE VAN ANTIBIOTICARESIDUEN IN MELK
– GEINTEGREERD DETECTIESYSTEEM
HOEVE
behandelde
koeien
respectering
wachtperiode
ex-farm melk
• testen op remstoffen
ZUIVELBEDRIJF
VOEDSELAGENTSCHAP
autocontrole
bv. artikel 14
EEG Richtlijn 92/46
• verzekeren
• <MRL volgens Verordening
No. 37/2010, 675/92 etc. voor
• testen op MRL
• antibiotica
(kwantitatief)
• sulfonamiden
• ‘Zero’ tolerantie voor
• resultaat:
• chlooramphenicol, dapson
• resultaat: penalisatie bij
een “positief” testresultaat
• doel: respectering MRLs
>MRL = recall / boete
(HEESCHEN & SUHREN, 1996)
ILVO
ANTIBIOTICATESTEN OP DE HOEVE
Testen van individuele koemelk i.p.v. tankmelk
- Na respectering van de wachtperiode
Copan Milk Test, Charm Cowside II test,
Delvotest SP-NT mini, Delvotest T mini,
Eclipse Farm 3G + e-reader,...
Microbiële inhibitortest met Geobacillus
stearothermophilus var. calidolactis als testorganisme
- Mogelijkheden:
- individuele vials
- kleine incubator (/reader)
- visuele aflezing of e-reader
- breedspectrum
- vooral gevoelig voor penicillines,
cefalosporines, sulfonamiden
Bepaalde melkveehouders experimenteren met sneltesten
ILVO
TESTEN VAN HOEVEMELK (ex-farm melk) IN
BELGIE
In België wordt elke levering bemonsterd en gecontroleerd op
remstoffen
Screening met de Delvotest T (Geobacillus stearothermophilus) in
microtiterplaten (sinds 01/09/2012)
Reflectometrische aflezing + Delvoscan software (z-waarden)
cut-off bij -3,0
Verder onderzoek met sneltesten en herhaling test alvorens
toekenning van penalisatie (29,75 € per 100 l melk)
Screening
no penalization, no post-screening
Z-value <-3.0, neg
penalization -lactam
Z-value ≥-3.0, pos
ratio  0.20, pos
eta-s.t.a.r.
ratio >0.20, pos no penalization
low quantity of -lactam
Combo
ratio ≤(mean ratio blanks - 4×SD), pos
Delvotest T
Postscreening
ratio >(mean ratio blanks - 4×SD), neg
Delvotest T
Pro-reader
no penalization, repeatability of Delvotest T
Z-value <-3.0, neg
post-screening stopped
Z-value ≥-3.0, pos
milk + β-lactamase
Delvotest T
no penalization, low quantity of -lactam,
Z-value <-3.0, neg
post-screening stopped
Z-value ≥-3.0, pos
penalization tetracyclines
pos tetra channel
Trisensor
4-Aminosensor
neg
Tylosensor
ILVO
neg
pos -lactam
pos
pos sulfa channel
channel
penalization
penalization aminoglycosides
Sulfonamides no penalization after verification at ILVO
low quantity of
Cut-off TriSensor, 4-Aminosensor,
-lactam
penalization quinolones
Tylosensor and Quinosensor: 1.10;
after verification at ILVO pos
ratio ≤1.10, pos; >1.10, neg
samples to ILVO
neg
pos
penalization tylosin
Quinosensor
neg
no penalisation
ILVO
TESTEN VAN HOEVEMELK (ex-farm melk) IN
BELGIE
Positive Delvotest T
Postscreening I
ratio  0.20, pos
penalization -lactam
no penalization
eta-s.t.a.r.
ratio >0.040, pos low quantity of -lactam
Combo
ratio ≤(mean ratio blanks - 4×SD), pos
ratio >(mean ratio blanks - 4×SD), neg
Further post-screening
βeta-s.t.a.r. Combo: verdunning melk + cut-off 0,20 (Accuscan PROreader)
 laat discriminatie toe tussen 3 en 4 µg/kg benzylpenicilline
3 µg/kg benzylpenicilline: steeds negatief resultaat
4 µg/kg benzylpenicilline: steeds positief resultaat (penalisatie)
 penalisatieniveau: tussen 3 en 4 µg/kg benzylpenicilline
2015: 1 156 276 hoevemelkstalen: 304 (0,026%) positief
Merk op: resultaat pas gekend als de melk al verwerkt is
ILVO
TESTEN VAN EX-FARM MILK IN NEDERLAND
- Screening van elke levering: Delvotest T
- Post-screening: herhaling Delvotest T na verhitting melk
(neutralisatie bepaalde natuurlijke remstoffen)
- Schijfjesmethode in plaat (calidolactis-test)
diameter inhibitiezone > zone benzylpenicilline 0,0037 IE/ml
(= 2,2 µg/kg): korting
 kortingsniveau: vanaf 2,2 µg/kg benzylpenicilline
 korting ook mogelijk omwille van remstoffen (niet-antibiotica)
2015: 2 255 500 hoevemelkstalen: 257 (0,010%) positief
Sinds 1 april 2015: Onderzoek van kortingsgevallen tot op
stofniveau met LC/MS-MS + oorzaakanalyse:
> MRL: melding aan COKZ en NVWA
ILVO
OORZAKEN VAN VALSPOSITIEVE RESULTATEN
BIJ MICROBIOLOGISCHE INHIBITIETESTEN
• lactoferrine, lysozyme in colostrum- en mastitismelk
• hoge pH (> 7.0)
- melk van koeien met chronische subklinische mastitis
- residuen of alkalische desinfectieproducten of detergenten
• hoog somatisch celgetal
• hoge concentratie aan melkvet of melkeiwit; laag eiwit
• hoge concentratie aan capryl-, caprine-, laurine- of myristinezuur
in melk door de activiteit van melkeigen lipase of bacteriële lipasen
• vitaminebindende eiwitten, mineralen of oligo-elementen
 kans op vernietiging van conforme melk
Remedie:
- verhitten, afromen of afromen & verhitten van de melk
- gebruik van een test met een ander testprincipe
9
ILVO
INHIBITIE DOOR VETZUREN (0,15% w/v in melk)
Delvotest
Delvotest
CMT
MCS
SP
Vetzuur
boterzuur*
capronzuur*
caprylzuur*
caprinezuur*
laurinezuur*
myristinezuur*
palmitinezuur*
stearinezuur*
palmitoleïnezuur
oliezuur
linolzuur
α-linoleenzuur
elaïdinezuur
vacceenzuur
* verzadigd
(4:0)
(6:0)
(8:0)
(10:0)
(12:0)
(14:0)
(16:0)
(16:0)
(16:1n-7)
(18:1n-9)
(18:2n-6)
(18:3n-3)
(18:1trans-9)
(18:1trans 11)
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
Charm BlueYellow II
+
+
+/-
+
+
+
Eclipse
3G
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
BR-AS
special
+
+
+
+
data ILVO
10
ILVO
INHIBITIE DOOR BACTERIELE BACTERIOCINES
Probleemstelling:
Melk van hoeves met frequente positieve resultaten in het kader van de
uitbetaling van de rauwe melk
- positief op Delvotest, zelfs na een hittebehandeling
- geen aanduiding van antibioticaresiduen
Staalname van individuele koemelk en tankmelk; cut-off Delvotest=-3,0
Melk
SCC
(x103
ml-1)
pH
Delvotest
(d+1)
Delvotest
(d+3)
Vetoxidatie
(d+3,5)
(meq O2 kg-1
vet)
Vrije
vetzuren
(d+3,5)
(% oliezuur
100 g-1 vet)
koe 9
1407
6,76
-7,56
-2,67
0,13
0,1329
tank
168
6,64
-3,32
-0,10
1,24
0,1415
tank
179
6,65
-3,47
0,21
1,24
0,1415
blanco milk
159
6,80
-8,96
-6,87
0,09
0,0665
d: dag staalname
11
INHIBITIE DOOR BACTERIELE BACTERIOCINES
• Isolatie van bacteriën:
- psychrotroof (groei bij 7°C)
- haemolytische en proteolytische activiteit
- vetoxidatie
• rpoB sequence analysis: meest verwant met Pseudomonas tolaasii
ILVO
• Bacteriële toxines geïdentificeerd als cyclische lipodepsipeptiden
van de viscosine-groep (Reybroeck et al., 2014, PLoS ONE)
12
ILVO
INHIBITIE DOOR MELKSAMENSTELLING
Melkparameter
melk met normale samenstelling
kiemgetal >108 per ml
SCC 5×105 - 106 per ml
SSC >106 per ml
vet <2 g per 100 ml
vet >6 g per 100 ml
eiwit <2,5 g per 100 ml
eiwit >4 g per 100 ml
% Valspositieve resultaten
Charm BY II Eclipse 3G Delvotest T
n*
%
n*
%
n*
%
1717
20
232
145
10
82
10
10
0,2
0,0
6,5
33,8
0,0
12,2
30,0
40,0
435
nt
198
117
nt
72
nt
nt
0,9
nt
15,7
32,5
nt
29,2
nt
nt
403
nt
68
69
nt
46
9
nt
2,7
nt
19,1
47,8
nt
8,7
0,0
nt
bacteriële bacteriocines
ja
ja
ja
pH >7,0
ja
ja
ja
data ILVO
n*: aantal geteste stalen
nt: niet getest
13
ILVO
INGANGSCONTROLE VAN RMO-MELK: BE
Bij jaarlijkse aankoop > 2 000 000 liter rauwe melk
Verplichting tot controle van de melk voor verwerking
- op niveau opslagtank
- of op niveau RMO-wagen
Lijst van door FAVV erkende sneltesten; erkenning op basis
van acceptatiecriteria (detectie β-lactam)
- βeta-s.t.a.r. combo v1.0 (Neogen Corporation)
- BetaXpress Milk MRL KIT044 (Unisensor s.a.)
- Charm MRLBL (ROSA) (Charm Sciences Inc.)
- Charm MRLBL1 (Charm Sciences Inc.)
- Charm MRLBL3 (Charm Sciences Inc.)
- SNAP ST (IDEXX Laboratories Inc.)
- SNAPduo ST (IDEXX Laboratories Inc.)
- TwinSensor KIT020 (Unisensor s.a.)
- TriSensor KIT035 (Unisensor s.a.)
ILVO
DETECTIECAPACITEIT FAVV ERKENDE
SNELTESTEN INGANGSCONTROLE MELK (deel 1)
Marker
residue
benzylpenicilline
ampicilline
amoxicilline
cloxacilline
nafcilline
ceftiofur
desfuroylceftiofur
cefquinome
cefazoline
cephapirine
desacetylcephapirine
cefoperazone
cefalexine
cefalonium
MRL
μg kg-1
4
4
4
30
30
100
100
20
50
60
60
50
100
20
Detectiecapaciteit (μg kg-1)
βeta-s.t.a.r. BetaXpress Charm
Charm
combo (v1.0) Milk KIT044 MRLBL MRLBL1
ROSA
4
2
2
2
4
3
3
4
4
3
3
4
5
9
25
16
12
100
45
150
90
10
6
16
1000
60
8
90
8
20
14
≤20
40
12
10
20
9
4
5
30
3
20
7
≤60
8
1
4
1
700
900
15
1750
5
2
3
9
Resultaten validatiestudies ILVO-T&V
15
ILVO
DETECTIECAPACITEIT FAVV ERKENDE
SNELTESTEN INGANGSCONTROLE MELK (deel 2)
Marker
residue
MRL
μg kg-1
Detectiecapaciteit (μg kg-1)
Twin TriSenso
Charm
SNAP SNAP
ST duo ST Sensor r KIT035
MRLBL3
*
KIT020
Pearl
EZ
3
3
3
2
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
25
25
5
5
8
9
175
175
4
4
80
70
14
14
12
14
10
10
≤100 ≤100
70
70
≤100
≤100
20
20
16
18
16
20
25
30
30
40
12
18
9
10
25
35
4
5
≤60
≤60
≤60
70
70
≤60
benzylpenicilline
4
ampicilline
4
amoxicilline
4
cloxacilline
30
nafcilline
30
ceftiofur
100
desfuroylceftiofur
100
cefquinome
20
cefazoline
50
cephapirine
60
desacetylcephapirin
60
e
cefoperazone
50
2
2
40
35
4
3
cefalexine
100
1250 1250 >7500 >7500
1250
800
cefalonium
20 validatiestudies
12
12 ILVO-T&V,
20
20
4
4
Resultaten
behalve
* (DQPA)
16
ILVO
INGANGSCONTROLE VAN RMO-MELK: BE
SECTOR PROTOCOL
SNELTEST (β-lactam) OP RMO-MELK
+
+
-
+
HERHALING ZELFDE SNELTEST
(intern lab)
+
- (2x)
+
MICROBIOLOGISCHE TEST
+
AFKEURING (VERNIETIGING)
HUMANE CONSUMPTIE
Beschikking 2006/694/EG: melk met een positief resultaat voor
een screeningstest dient als onveilig te worden beschouwd
ILVO
MONITORING IN HET KADER VAN MONIMILK
EN DOOR FAVV
Richtlijn 96/23/EG & Beschikking 97/747/EG: Nationaal
residuplan
Verplichting tot jaarlijkse controle van o.a. melk: 1 staal per
15 000 ton geproduceerde melk; minimum van 300 stalen
-
diverse matrices: melk(poeder), room,…
ad random staalname
batterij aan testen + ook LC-MS/MS
monitoring van antibiotica, chemotherapeutica,
antiparasitaire stoffen, niet-steroïdale ontstekingsremmers,
pesticiden, melamine, aflatoxine M1,…
- steeds bepaling van de substantie en kwantificatie ter
vergelijking met de norm (MRL of ML) (LC-MS/MS)
ILVO
VALIDATIE VAN SCREENINGSTESTEN
Beschikking van de Commissie 2002/657/EG
kwalitatieve
methoden
Kwantitatieve
methoden
Aantoonbaarheidsgrens CC
Beslissingsgrens CCα
Juistheid/
Terugvinding
Precisie
Selectiviteit
/
Specificiteit
Toepasbaarheid/
Robuustheid/
Stabiliteit
S
+
-
-
-
+
+
C
+
+
-
-
+
+
S
+
-
-
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
S: screeningstesten; C: bevestigingsmethoden
Guidelines for the validation of screening methods
(CRLs, January 20, 2010)
- primaire validatie
- transfervalidatie
ILVO
DETECTIECAPACITEIT DELVOTEST T
Familie
Merkerresidu
cefalosporinen
tetracyclines
cefquinome
4 epimeer van
chloortetracycline
dihydrostreptomycine
kanamycine A
enrofloxacine
colistine
benzylpenicilline
cloxacilline
cefazoline
(desacetyl)cephapirine
sulfadimethoxine
neomycine B
aminoglycosiden
quinolonen
polymyxines
penicillines
cefalosporinen
sulfonamiden
aminoglycosiden
MRL (µg kg-1)
ccβ (µg kg-1)
20
60
100
1000
200
150
100
50
4
30
50
60
100
1500
1500
1500
1500
400
1
8
4
(2)2
16
150
Detectiecapaciteit niet in lijn met resp. MRLs.
Lijst niet beperkt.
20
ILVO
DETECTIECAPACITEIT SNAP ST
benzylpenicillin (4)
cef alonium (20)
ampicillin (4)
cef alexin (100)
cef operazone (50)
cef acetrile (125)
desacetylcephapirin (60)
cephapirin (60)
cef azolin (50)
cef quinome (20)
amoxicillin (4)
oxacillin (30)
cloxacillin (30)
dicloxacillin (30)
naf cillin (30)
cef tiof ur (100)
desf uroylcef tiofur (100)
Binnencirkel = 2 MRL; cirkel 2 = MRL; cirkel 3 = 0,5 MRL;
cirkel 4 = 0,25 MRL. MRL in µg/kg, vermeld tussen haakjes.
ILVO
ratio
ratio
Betachannel
3 ppb)
TESTROBUUSTHEID
MILK –
Betachannel(blank
(blank- pen
- pen
3 4SENSOR
ppb)
MELKINVLOEDEN OP β-LACTAMKANAAL
6,0
6,0
5,5
5,5
5,0
5,0
blanco melk
benzylpenicilline 3 µg/kg
4,5
4,5
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
1. normal raw milk = reference
2. somatic cells, >106 ml-1
3. TBC > 5·105 ml-1
4. low fat, <2 g 100 ml-1
5. high fat, >6 g 100 ml-1
6. low protein, <3 g 100 ml-1
7. high protein, >4 g 100 ml-1
8. pH 6.0
9. pH 7.5
1
1
2
2
3
4
3
5
4
6
5
7
8
9
6milk quality/composition
7
8
9
milk quality/composition
min blank
max
min blank
blank
mean
blank
max blank
min
penblank
3 ppb
mean
max
min pen
pen33ppb
ppb
mean
pen 3
max pen
3 ppb
ppb
cut-off
mean pen 3 ppb
cut-off
valsnegatieve resultaten
valspositieve resultaten
ILVO
reader value
TESTROBUUSTHEID CHARM MRL1 TEST –
MRLBL1 Milk type-benzylpenicillin 3 µg/kg
MELKINVLOEDEN
OP β-LACTAMKANAAL
2000
benzylpenicilline 3 µg/kg
1000
0
-1000
valsnegatieve
resultaten
-2000
1
2
3
4
5
6
milk type
Maximum reading
( ), Average reading ( ), Minimum reading (
), Con
Minimum
Maximum
positive
from
( rauwe ),
Legend:
1=reference: normal
raw milk, 2=U
1. referentie
= normale
melk
4. gereconstitueerde
melkpoeder
Meannegative
Cut-off
2. UHT melk
geitenmelk
reconstituted
powder, 5= goats’ milk,5.6= mares’
milk.
3. gesteriliseerde melk
6. paardenmelk
ILVO
ANTIBIOTICARESIDUEN IN HONING
Antibiotica en sulfonamiden worden soms door de imker ingezet
tegen bacteriële broedziekten (Amerikaans en Europees vuilbroed)
en Nosemose.
Andere besmettingsbronnen:
- behandeling van fruitbomen met streptomycine tegen bacterievuur
- gecontamineerd drinkwater
- medicatie van andere diersoorten (reisduiven,…)
- vanuit mest
- metabolisatie tot sulfanilamide vanuit herbicide asulam
- door bijmenging of voedering van gecontamineerde importhoning
Geen MRLs gefixeerd voor antibiotica in honing (actielimieten in BE)
Geen metabolisatie, lange verblijftijden in de honing in de bijenkast
Richtlijn 96/23/EG & Beschikking 97/747/EG: Nationaal residuplan
Verplichting tot jaarlijkse controle van honing: 10 stalen per 300 ton
(eerste 3000 ton productie), nadien 1 staal per 300 ton
ILVO
RASFF NOTIFICATIES OMWILLE VAN
ANTIBIOTICARESIDUEN IN HONING: 2002-2010
Familie
Substantie
aminoglycosiden
streptomycine
dihydrostreptomycine
amphenicolen
chlooramphenicol
sulfonamiden
sulfadiazine
sulfathiazole
sulfamerazine
sulfamethoxazole sulfamethoxine
sulfamethazine
sulfadimethoxine
tetracyclines
tetracycline
oxytetracycline
macroliden
tylosine
erythromycine
lincosamiden
lincomycine
nitrofuranen
AOZ
AMOZ
fluoroquinolonen
ciprofloxacine
enrofloxacine
diaminopyrimidine trimethoprim
derivaten
nitroimidazolen
metronidazole
doxycycline
SEM
ILVO
TRENDS IN ANTIBIOTICARESIDUEN IN
EUROPESE COMMERCIELE TAFELHONING
2002
2005
2009
2012
België
%
%
%
n
n %
n %
n
n
Pos n
Pos n
Pos n
Pos
Pos Pos
Pos Pos
Pos
*
*
*
20 13 65 21 4 19 14 21 2 10 5 40 0
Italië
20
3
15
19
6
32
11
15
2
13
7
---
---
Portugal
20
10
50
20
7
35
35
20
4
20
20
---
---
Spanje
20
7
35
20
0
0
0
15
3
20
7
---
---
Zwitserland
---
---
---
---
---
---
---
15
1
7
7
---
---
UK
---
---
---
20
3
15
0
---
---
---
---
---
---
Land
2002 *: controle op streptomycine, tetracyclines, sulfonamiden en CAP
2005: uitgebreid met macroliden/lincosamiden
2009: uitgebreid met macroliden/lincosamiden, quinolonen en nitrofuranen
data ILVO
ILVO
ANTIBIOTICARESIDUEN IN LOKAAL
GEPRODUCEERDE VLAAMSE HONING
Substantie
Positieve honingstalen / aantal geteste honingstalen
20002002 2003 2004 2005
2001
2006
2009
2012
en 2008 en 2011 en 2014
2007
2010
2013
streptomycine
4/248 0/90
---
0/10
0/20
0/15
0/25
0/20
0/20
0/20
1/10
tetracyclines
2/72
0/90
---
0/10
0/20
0/15
0/25
0/20
0/20
0/20
0/10
sulfonamiden
3/72
3/91 12/203 0/20
0/20
0/15
0/35
0/30
1/30
0/30
0/10
chlooramphenicol 0/93 0/226
---
0/10
0/20
0/15
0/25
0/20
0/20
0/20
0/10
-lactams
0/50
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
macroliden/
lincosamiden
---
---
---
---
---
0/15
0/25
0/20
0/20
0/20
0/10
fluoroquinolonen
---
---
---
---
---
0/15
0/25
0/20
0/20
0/20
0/10
Sulfonamiden tot 13194 µg/kg (2003) en 5200 µg/kg (2011);
streptomycine: 3 µg/kg (2014)
data ILVO
ILVO
SCREENING VAN ANTIBIOTICARESIDUEN IN
HONING
Geen MRLs: lage concentraties moeten kunnen worden aangetoond
Microbiologische inhibitortest: Premitest: actielimieten vaak niet
gehaald
Receptortesten:
- dipsticks: TetraSensor Honey (tetracyclines)
SulfaSensor honey (sulfonamiden)
Bee4sensor (tylosine, quinolones, sulfonamiden en CAP)
- Charm II testen (≠ families)
ELISA: ≠ families
Biochip Array Technology (Randox): 22 componenten, ≠ families
Screening met LC-MS/MS
ILVO
CONCLUSIES
• De zuivelsector heeft een lange traditie in het
systematisch testen van antibioticaresiduen
• Screeningstesten spelen daarbij een belangrijke rol
• Problematiek van antibioticaresiduen in honing is
teruggedrongen o.a. door controleprogramma’s
• Validatie van screeningstesten is belangrijk en een must
om een juiste keuze van test toe te laten
ILVO
Dank U
[email protected]
Instituut voor Landbouw- en
VisserijOnderzoek
Brusselsesteenweg 370
9090 Melle – België
T + 32 (0)9 272 30 11
F +32 (0)9 272 30 01
t&[email protected]
www.ilvo.vlaanderen.be