Transcript Гриднева В

Гриднева В.В., Куликова И.Ю.
ФГОУ ВПО «Астраханский Государственный Технический
Университет», Россия
Исследование мезофильного и психрофильного
микробного сообщества Северного Каспия, способного к
деструкции нефти и нефтепродуктов
Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами приобретает
глобальный характер. В морских экосистемах повсеместно наблюдаются
сброс и случайное попадание этих соединений в природную среду в
результате добычи, транспортировки и хранения углеводородного сырья. Для
защиты окружающей среды от загрязнений нефтепродуктами существуют
химические,
физические
и
биологические
методы.
Наиболее
востребованными в последнее время являются экологически чистые
биотехнологические методы защиты. Эти методы основаны на
использовании
микроорганизмов-деструкторов
углеводородов.
Микроорганизмы, развивающиеся в местах нефтяного загрязнения,
адаптированы к нефтяным углеводородам и обладают более высоким
углеводородокисляющим
потенциалом
в
результате
индукции
специфических ферментов и пластичности метаболизма [Leahy, 1990, p. 305315]. Установлено, что решающую роль в процессе трансформации нефти и
нефтепродуктов до простых соединений выполняют микроорганизмы
[Квасников, 1981, с. 14-15], многие из которых способны разрушать
углеводороды. Одним из важных факторов, влияющих на способность
микроорганизмов к разрушению нефти и нефтяных углеводородов, является
температура. Наиболее оптимальными для развития микроорганизмов –
деструкторов являются мезофильные условия, то есть 20 – 28 º С. При
температуре 6 – 15 º С интенсивность трансформации нефти снижается в 2,5
– 4 раза [Квасников, 1981, с. 72 – 73]. Уменьшение температуры воды на
каждые 5 º С сопровождается непропорциональным снижением
биологической активности микроорганизмов [Петров, 1978, с. 52]. В связи с
этим актуальным является поиск и выделение аборигенных мезофильных и
психрофильных микроорганизмов, способных к деструкции нефти и
нефтепродуктов, для того чтобы процесс биоремедиации активно проводился
при любой температуре.
Из шельфовых вод Северного Каспия методом накопительных культур на
жидких средах Миллса, М-9, Чапека, МКД с добавлением нефти, дизельного
топлива и керосина с последующим высевом на плотные среды того же
состава с вышеуказанными нефтепродуктами были выделены 67 штаммов
микроорганизмов.
Инкубация
накопительных
культур,
выделение
углеводородокисляющих микроорганизмов и изучение их активности
проводилась при температуре 6 º С для выявления психрофилов и 28 º С для
мезофилов. Исследование активности штаммов по отношению к нефти,
дизельному топливу и керосину проводили методом лунок по Егорову
[Руководство к практическим занятиям, 1983, с. 135]. В результате были
отобраны 26 мезофильных и 5 психрофильных штаммов, наиболее активно
развивающихся в присутствии нефти и нефтепродуктов. Деструктивную
активность штаммов по отношению к сырой нефти изучали на стерильной
морской воде. Стерильную нефть вносили в количестве 1% по отношению к
объему морской воды, суспензии исследуемых штаммов вносили по 2%.
Титр клеток составлял 106-107кл/мл. Содержание нефтепродуктов в
эксперименте определяли гравиметрическим методом после 15 суток
экспозиции, в качестве элюента использовали хлороформ [Белоусова, 2002, с.
514]. Убыль углеводородов определяли по отношению к контролю без
внесения штаммов, который имитировал убыль нефтяных фракций за счет
физико-химических процессов.
В результате проведенного эксперимента установлено, что среди
мезофильных микроорганизмов 22 штамма в различной степени способны к
деструкции нефти (рис. 1). Наибольшую активность проявляли штаммы № 1,
15, 16, 23, вызывающие более 40% убыль нефти. Меньшей активностью
обладали штаммы № 3, 8, 13, 20, 25 разлагающие от 30 до 40 % нефти.
Установлено, что психрофильные штаммы также способны к деструкции
нефти, но в меньшей степени, чем мезофильные. Среди них три штамма
(П1, П4, П5) оказались наиболее активными, утилизируя от 13,5 до 26 %
нефти.
Рисунок 1. Деструкция сырой нефти мезофильными (М 1 – М 26) и
психрофильными (П 1 – П 5) штаммами за 15 сут экспозиции
Нерастворимость нефти в воде в значительной степени препятствует
проникновению ее в клетки микроорганизмов для дальнейшего усвоения.
Поэтому
большое
значение
имеет
степень
диспергированности
углеводородов в среде. Некоторые углеводородокисляющие микроорганизмы
продуцируют
эмульсифицирующие
агенты
(биоэмульсификаторы,
биосурфактанты), которые способны снижать поверхностное натяжение и
повышают их способность деградировать углеводороды [Гоготов, 2005, с.
54].
Эмульгирующую активность выделенных штаммов определяли
методом методом Купера [Cooper, 1987, Р. 226]. В качестве гидрофобной
фазы для эмульгирования использовали керосин, бензин и дизельное
топливо. Эксперимент проводился при температуре 6 º С для психрофилов и
28 º С для мезофилов. Измерение индекса эмульгирования определяли через
24 ч как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте
жидкости в пробирке и выражали в процентах. Исследование
эмульгирующих свойств культуральных жидкостей показало, что индекс
эмульгирования при смешивании с керосином, бензином и дизельным
топливом различен. Среди мезофилов 5 штаммов не обладали
эмульгирующими свойствами, 14 штаммов отличались высокой
эмульгирующей активностью (до 59 %). Причем большинство штаммов
активнее эмульгировали керосин (от 3 до 59 %), 10 штаммов обладали
способностью к эмульгации всех тестируемых нефтепродуктов (таб. 1).
Среди психрофилов два штамма обладали высокой эмульгирующей
активностью по отношению к дизельному топливу, один штамм - к керосину.
Наибольшую активность проявляет штамм № П5.
Таблица 1. Индекс эмульгирования исследуемых мезофильных (М 1 – М 26) и
психрофильных (П 1 – П 5) штаммов, %
№ штамма
М1
М2
М3
М4
М5
М6
М7
М8
М9
М 10
М 11
М 12
М 13
М 14
М 15
М 16
М 17
М 18
М 19
М 20
М 21
М 22
М 23
керосин
53
12
58,8
5,6
0
0
45
35,5
0
0
47
11,1
52,6
10
43
31
3,1
3,1
46,2
6,7
46,7
0
25
дизельное
топливо
36,6
34
17,6
2,8
15
0
22,2
5,2
0
0
0
0
58,8
0
2,9
50
0
45,5
42,2
7,1
50
0
36,7
бензин
6,3
40
46,7
0
0
0
22,7
48,2
0
0
0
53,3
47,5
4,1
12
32
5
17
43,3
1,2
36
0
6,1
М 24
М 25
М 26
П1
П2
П3
П4
П5
2,9
13,9
10
1,7
8,2
12,5
9
0
2,5
10
3,1
0
20,1
33,3
1,9
1,9
50
30
0
1,2
7,1
12,3
2,5
0
Таким
образом,
в
результате
проведенного
скрининга
углеводородокисляющих микроорганизмов Северного Каспия выделены как
мезофильные, так и психрофильные микроорганизмы, обладающие
способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, а также высокой
эмульгирующей активностью, что делает их перспективными объектами
биотехнологии в области защиты окружающей среды от нефтяного
загрязнения.
Литература
1. Белоусова Н.И. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции
нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах / Белоусова
Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. // Прикладная биохимия и
микробиология, 2002, т. 38, №5, с. 513-517.
2. Гоготов И.Н. Полисахариды: свойства, получение и практическое
использование. В: Материалы межд. научно - практич. конф.
«Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого
пространства стран содружества», Минск - Нароч: РИВШ, 2005. С. 5455.
3. Квасников Е.И. Микроорганизмы – деструкторы нефти в водных
бассейнах / Е.И. Квасников, Т.М. Клюшникова, Киев, Наук.думна,
1981, 131 с.
4. Петров Г.Н. Некоторые физические процессы самоочищения воды от
нефти // Гидробиологический журнал, 1978, Т. XVI, №4, с. 52 - 54.
5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии:
Практическое пособие /Под ред. Н.С.Егорова.- 2-е изд.-М.: Изд-во
Моск.ун-та, 1983.- 251с.
6. Cooper D.G., Goldenberg b.G. // Appl. Environ. Microbial. 1987. V. 53. №
2. Р. 224-229.
7. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial dеgradation of hydrocarbons in the
environment // Microbiol. Rev. - 1990. - vol.54. - p. 305-315.