Transcript IDENTIFICAZIONE DELLA MUTAZIONE V600E DELLA

IDENTIFICAZIONE DELLA MUTAZIONE V600E
DELLA PROTEINA BRAF
AMPLI-set-V600E BRAF
Cat. n. 1.423
I tumori della tiroide sono la causa più frequente di patologia maligna del sistema endocrino. Circa l’80% dei casi di tumore della
tiroide sono rappresentati dal carcinoma papillifero. Tale neoplasia frequentemente presenta alterazioni molecolari a carico dei geni
codificanti per proteine del pathway delle MAPK chinasi (Mitogen-activated protein kinase). Tale pathway regola processi cellulari
importanti quali la crescita ed il differenziamento cellulare, nonchè la risposta a fattori di crescita, ormoni e citochine. Le alterazioni
molecolari note coinvolgono due geni codificanti per recettori tirosino-chinasi, RET e NTRK1 e due geni codificanti per effettori
intracellulari della cascata delle MAPK chinasi, la proteina RAS e la serin-treonin chinasi BRAF. Circa il 70% dei carcinomi
papilliferi presenta alterazioni a carico di uno di questi geni. Infatti le varie mutazioni difficilmente coesistono nella stessa neoplasia.
La mutazione più frequente a carico del gene codificante per la proteina BRAF è la mutazione T1799A, che provoca la sostituzione
di un residuo di valina in un residuo di acido glutammico (V600E) nella proteina. Tale mutazione provoca l’attivazione costitutiva
della chinasi BRAF. Molteplici studi hanno dimostrato che la mutazione a carico del gene BRAF rappresenta circa il 45% delle
mutazioni riscontrate nei tumori papilliferi della tiroide dell’adulto. Inoltre tale mutazione è stata riscontrata anche in tumori
anaplastici e scarsamente differenziati della tiroide.
E’ evidente che conoscere l’alterazione molecolare presente nel tumore risulta di ausilio nella prognosi e nella terapia.
Il kit permette l’identificazione della mutazione V600E a carico della proteina BRAF. La metodica prevede l’amplificazione con
primers specifici di un frammento di 147 bp ed il taglio di restrizione con l’enzima HpyCH4-IV.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase e RNase free e monouso.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
Normale
Principio del metodo:
A) estrazione del DNA genomico
B) amplificazione
C) digestione enzimatica
D) rivelazione sul gel di agarosio.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
campione biologico proveniente da aspirato, da tessuto o da
sangue intero.
Numero di Test: 24.
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato (I
gel di agarosio, se conservati lontano dalla luce, sono stabili
per 12 mesi a temperatura ambiente).
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato;
puntali sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o
pasteurs di vetro); portaprovette refrigerato; tubi PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit:
-Reattivi per l’estrazione del DNA
Strumenti richiesti:
set di pipette pre-PCR e post-PCR: 1)0.5 – 10 microlitri 2) 5
– 50 microlitri 3) 50 – 200 microlitri 4) 200 – 1000
microlitri; Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard
classe II; Camera elettroforetica con alimentatore;
Transilluminatore UV; Apparato fotografico.
Etero zigote
T.A.
T.A.
-20°C
Il prodotto di amplificazione è un frammento di 147
bp.
La mutazione provoca la perdita del sito di taglio
per cui l’allele mutato presenta un pattern di
restrizione con un solo frammento (147 bp).
L’allele normale, invece, presenta un pattern di
restrizione con due frammenti (126 bp e 21 bp). Il
soggetto eterozigote, infine, presenta un pattern di
restrizione a tre frammenti (147, 126 e 21 bp).
Etero zigote
T.A.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Amplificato
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
Marker
AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE
PCR mix
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/l)
Enzima HpyCH4-IV (10 U/l)
BUFFER di digestione 10X
Controllo Normale
RIVELAZIONE
Gel precast di agarosio 3% per elettroforesi in
TBE 1X
Loading buffer 10 X
Buffer di corsa 10 X (TBE 10X)
Marker di peso molecolare (es ladder 100 bp)
200 bp
100 bp
REFERENZE:
Nature 2006, 439: 359-362.
Oncogene 2004, 23: 4060-4067.
Cell 2004, 16: 855-67.
Cancer Research 2003, 63: 4561-4567.
Endocr Relat Cancer 2005, 12: 245-262.
Endocr Pathol 2005, 16: 163-172.
Cancer Res 2005, 65: 4238-4245.
Nota: il protocollo finale potrebbe prevedere delle modifiche rispetto alla scheda
tecnica. Sarebbero, comunque, modifiche inserite per semplificare la procedura.