Transcript Lezione (7) XVII 08.05.14 Lipasi

Enzimi lipolitici: lipasi, esterasi e fosfolipasi
Le lipasi (EC 3.1.1.1) sono idrolasi che agiscono sul legame estereo dei
trigliceridi (acilgliceroli ) e di altri substrati
Estere carbossilico + H2O
Alcool + un carbossilato
Sono enzimi ubiquitari, presenti in tutti gli organismi viventi.
Negli eucarioti, si ritrovano nei lisosomi o nello spazio extracellulare.
Esse intervengono nel metabolismo, nell’assorbimento e nel trasporto
dei lipidi.
Negli eucarioti inferiori e nei batteri, le lipasi possono essere
intracellulari o essere secrete per degradare substrati lipidici presenti
nell’ambiente.
In alcuni organismi patogeni le lipasi rappresentano addirittura dei
fattori di virulenza (es in Candida albicans (fungo), Helicobacter pylori
(batterio gram negativo), responsabili della patogenicità.
Le lipasi batteriche e fungine sono le più utilizzate a livello
industriale come biocatalizzatori in quanto sono molto resistenti,
facili da produrre attraverso processi di fermentazione e facili da
estrarre dal brodo di coltura.
Lipasi da fonte vegetale (es. papaya, ananas, Euphorbia) ed in
particolare quelle presenti nei semi in germinazione come ricino,
olio di palma, colza) sono enzimi biotecnologicamente molto
interessanti perché agiscono enzimaticamente su acidi grassi
inusuali.
Alcune proprietà generali delle lipasi:
PM  da 20 kDa a 60 kDa
T ottimale  da 30°C a 60°C (> di 70°C negli organismi estremofili)
pH ottimale  intorno a 9,0 (meno comuni sono le lipasi con pH
ottimale acido)
SUBSTRATI delle LIPASI
I substrati naturali delle lipasi sono i composti lipidici insolubili, che tendono
facilmente alla aggregazione in soluzione acquosa.
Infatti, l’attività delle lipasi aumenta notevolmente quando la concentrazione del
substrato è superiore a quella limite di solubilità.
Questa proprietà è nota fin dal 1958 (Sarda e Desnuelle).
Questa caratteristica rappresenta la differenza fondamentale tra le “lipasi” e le
esterasi.
Queste idrolizzano il legame estereo di molecole solubili che seguono una
classica cinetica di Michaelis-Menten.
Le lipasi dunque catalizzano l'idrolisi dei trigliceridi all'interfaccia tra la i substrati
lipidici “aggregati” e la fase acquosa. Per questo motivo le lipasi sono noti come
“enzimi interfacciali”.
Questo comportamento, conosciuto come attivazione interfacciale,
ha trovato una spiegazione quando, anni dopo, è stata determinata
la prima struttura tridimensionale di una lipasi.
In assenza dell’interfaccia infatti il sito attivo di tali molecole è coperto da una
struttura secondaria che lo rende inaccessibile al substrato.
Tale struttura “mobile” si composta come un coperchio e viene definita appunto
“LID” o “FLAP”,
In presenza di un’interfaccia idrofobica invece le lipasi subiscono un importante
riarrangiamento conformazionale:
il LID viene spostato ed il sito attivo passa ad una conformazione attiva,
accessibile al substrato.
Conformazione
chiusa
Conformazione
aperta
Il LID è una struttura anfipatica:
1. nella conformazione chiusa dell’enzima, la sua faccia idrofilica è
rivolta verso il solvente, mentre quella idrofobica è diretta verso il
core dell’enzima.
2. Quando l’enzima passa alla conformazione aperta, il LID si sposta e
prende contatto con una parte idrofilica dell’enzima, mentre la parte
idrofobica del LID viene esposta e lega il substrato.
Amminoacido
catalitico
Le lipasi mostrano, a livello tridimensionale, una struttura comune nota come
ripiegamento a/b delle idrolasi
8 foglietti b centrali, tutti paralleli tranne il b2 che è antiparallelo;
i foglietti dal b3 al b8 sono collegati a 6 a-eliche.
Conformazione
chiusa
Conformazione
aperta
Il database SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop)
classifica le lipasi in 7 famiglie, sulla base della struttura
3D:
1. Acetilcolinesterasi-simili
2. Lipasi gastriche
3. Lipasi
4. Lipasi fungine
5. Lipasi batteriche
6. Dominio N-terminale delle lipasi pancreatiche
7. Cutinasi-simili
Acetilcolinesterasi
Lipasi gastrica umana
Lipasi pancreatica equina
legata alla colipasi
Lipasi da
Bacillus subtilis
Cutinasi
Il sito attivo è formato da una triade catalitica che comprende un nucleofilo, un
residuo acido ed un’istidina (come le serin-proteasi, ma con un ordine diverso dei
residui):
Ser - Asp/Glu – His
Altamente conservata è la presenza di un “gomito”, costituito da un ripiegamento
g (definito da un legame idrogeno tra il gruppo carbonilico di un amminoacido e il
gruppo amminico dell‘amminoacido due residui più avanti nella sequenza), che
contiene il residuo di serina posizionato tra un foglietto b e un’a-elica.
Come già detto, gli enzimi lipolitici esplicano la loro azione catalitica
all’interfaccia tra la fase acquosa, in cui l’enzima è solubile, e la fase lipidica del
substrato.
Questo tipo di catalisi è un esempio di catalisi eterogenea.
Verger e Rietsh (1973 e 1977) hanno proposto un meccanismo catalitico per
questi enzimi formato da tre stadi.
Nel primo si ha l’adsorbimento dell’enzima solubile in acqua all’interfaccia.
E→Ea(dsorbito)
Il secondo è lo stadio catalitico vero e proprio, con formazione del complesso di
Michaelis-Menten.
Ea+S→EaS (complesso)
Infine, nel terzo stadio si forma il prodotto e si ha la rigenerazione dell’enzima
adsorbito.
EaS→Ea+P
IL MECCANISMO DI IDROLISI
1. Le caratteristiche nucleofile del residuo di Ser sono rafforzate dal trasferimento di un
protone all’His del sito catalitico, con la formazione di un ossianione che attacca il
gruppo carbonilico del legame estereo da idrolizzare. Si forma un intermedio
tetraedrico con una carica negativa sull’atomo di ossigeno carbonilico del legame
estereo, che è stabilizzata attraverso legami idrogeno con i gruppi NH della catena
principale dell’enzima. Il protone dell’His viene poi trasferito all’ossigeno del legame
estereo che viene tagliato e si forma un acil-enzima intermedio (residuo di Ser
dell’enzima esterificato con l’acido grasso del substrato).
2. La deacilazione dell’enzima avviene ad opera di una molecola d’acqua che idrolizza
l’intermedio covalente.
Alcune lipasi eucariotiche sono caratterizzate da caratteristiche addizionali,
dovute alla necessità di svolgere attività quali:
1. interazione con lipidi in condizioni sfavorevoli
2. interazione con le membrane
3. interazione con altre molecole
4. più raramente, regolazione
La lipasi pancreatica è uno di questi esempi meglio caratterizzato.
Essa è costituita da due domini collegati da una cerniera flessibile, un largo
dominio catalitico N-terminale e un dominio C-terminale b-sandwich, collegato al
caratteristico ambiente fisiologico in cui è attivo l’enzima.
Lipasi pancreatica equina
legata alla colipasi
L’azione della lipasi pancreatica è mediata dal legame con una proteina – la
colipasi – secreta dal pancreas.
La colipasi, con PM 10.000, che può essere considerato un cofattore, è una
proteina anfipatica capace di collegare la lipasi all’interfaccia lipidica e
stabilizzarla nella conformazione aperta attiva  il cofattore (colipasi) prende
contatto con la forma lid aperta (attiva) dell’enzima e con essa forma un larga
superficie idrofobica capace di interagire fortemente con l’interfaccia
acqua/lipide.
La colipasi inoltre impedisce ai sali biliari di legare l’enzima con effetto inibitorio.
Applicazioni
Le lipasi sono estremamente utilizzate nell’industria lattiero-casearia per
idrolizzare i lipidi del latte, per:
1. Favorire la formazione degli aromi nei formaggi
2. Accelerare i processi di maturazione del formaggio
3. La produzione di prodotti a base di formaggio
4. Idrolizzare i grassi del burro e delle creme.
Gli acidi grassi prodotti dall’azione delle lipasi sui grassi del latte conferisce
ai formaggi, in particolar modo a quelli molli, il caratteristico aroma.
Lipasi che idrolizzano catene corte (C4, C6)  sapore tagliente, piccante
Lipasi che idrolizzano catene medie (C12, C14)  sapore saponoso, untuoso
Inoltre, gli acidi grassi rappresentano un substrato per la popolazione
microbica presente nel formaggio (si formano acetoacetati, b-chetoacidi,
chetoni metilici, esteri e lattoni).
CAMBIAMENTI DEI LIPIDI NELLA MATURAZIONE DEL FORMAGGIO
Enzima o azione
Lipolisi
Lipasi, esterasi
Acetoacetato decarbossilasi
(EC 4.1.1.4)
Reazione
Trigliceridi —> b-chetoacidi, acetoacetato,
acidi grassi
Acetoacetato + H+ —> acetone + CO2
Acetoacetato-CoA ligasi
(EC 6.2.1.16)
Acetoacetato + ATP + CoA —> acetil CoA
+ AMP + difosfato
Esterasi
Acidi grassi —> esteri
Conversione di acidi grassi
b-ossidazione e
decarbossilazione
b-cheto acidi --> metil chetoni
Interesterificazione
“Interesterificazione” è la tecnica utilizzata nel processo industriale che porta
alla ridistribuzione degli acidi grassi nelle molecole dei trigliceridi.
In questo termine sono compresi:
1. Acidolisi  reazione tra un acido grasso e un gliceride, che introduce l’acido
nella molecola del gliceride al posto di quelli già presenti;
2. Alcolisi  reazione tra un alcool e un trigliceride che produce esteri diversi dai
gliceridi di partenza;
3. Transesterificazione  trasposizione degli acidi grassi o all’interno dei singoli
gliceridi di una sostanza grassa (intraesterificazione) o tra tutti i gliceridi
presenti in una miscela (interesterificazione).
Questo caso interessa l’industria degli oli e dei grassi, dal momento che le
trasposizioni possono determinare modificazioni che migliorano le
caratteristiche di un olio o di una miscela di oli e grassi.
La reazione di interesterificazione può essere effettuata utilizzando le lipasi,
che possono agire in maniera:
1. Aspecifica
2. Specifica per le posizioni 1 e 3 del trigliceride
3. Specifica per gli acidi grassi.
L’interesterificazione ha due settori di impiego:
1. Cambiamento o stabilizzazione della
struttura cristallina dei grassi 
i grassi alimentari sono caratterizzati da
diverse forme cristalline. Quelle più
importanti nella produzione dei grassi
idrogenati, ad es. delle margarine, sono le a,
b’ e b (riportate in ordine crescente di
stabilità) e delle quali la b’ è quella che
conferisce le caratteristiche più desiderate.
I cristalli b’ sono piccoli e riescono
ad incorporare anche la parte che è
rimasta liquida dell’olio dando alla
margarina un'apparenza lucida ed
una consistenza vellutata.
ES.
- Lo strutto cristallizza nella forma b a causa dell’elevato tenore di acido palmitico nella
posizione 2 dei trigliceridi insaturi, ma nella “randomizzazione” questa proporzione di
acido palmitico si riduce dal 64 al 24% e, di conseguenza, il prodotto interesterificato
cristallizza nella forma b’, con miglioramento delle sue caratteristiche;
- Le strutture cristalline delle margarine fabbricate con olio di girasole vengono stabilizzate
nella forma b’ per effetto dell’interesterificazione.
2. Cambiamento delle caratteristiche di fusione e di cristallizzazione di
singoli oli o miscele di oli 
il fatto che l’interesterificazione modifichi il punto di fusione dei grassi è
stato sfruttato per produrre margarine dietetiche
- con elevato contenuto di acidi polinsaturi
- prive o con un contenuto trascurabile di isomeri trans,
oppure
- per produrre grassi per pasticceria con caratteristiche di fusione idonee
al consumo degli alimenti ai quali sono destinati.