IDENTIFICAZIONE DELLE MICRODELEZIONI DELLA REGIONE AZF DEL CROMOSOMA Y

AMPLI-SET Y Cromosoma gr/gr Cat. n.1.501/gr

La regione AzfC del cromosoma Y è costituita quasi interamente da blocchi di sequenze ripetute, detti ampliconi. A causa di questa struttura ripetitiva ,la regione AzfC è particolarmente suscettibile ad eventi di ricombinazione di omologhi intracromosomiali, che possono portare a delezioni. Sono stati identificati diversi riarrangiamenti nella regione AzfC , ed alcuni di essi sono stati descritti come causa di diretta o fattore di rischio per l’infertilità maschile. La delezione completa della regione AzfC (delezione b2/b4) è la più comune causa genetica conosciuta di difetto della spermatogenesi. Recentemente sono stati riportati nuovi tipi di delezioni della regione AzfC , le delezioni parziali, che rimuovono circa metà del contenuto del gene AzfC , includendo due geni DAZ , una copia del gene CDY1 ed una copia del gene BPY2. Esse sono dovute allo stesso meccanismo molecolare che produce la microdelezione completa della regione AzfC. La delezione parziale gr/gr è considerata un fattore di rischio genetico per il danneggiamento della spermatogenesi da numerosi ricercatori. Le delezioni gr/gr vengono individuate utilizzando la PCR (Polymerase Chain Reaction) di alcuni “sequence tagged sites”(STSs): sY 1291-sY1191-sY1206-sY1201-sY142 sY1197.L’assenza dell’STS sY1291 e la contemporanea presenza degli altri STSs indica la delezione parziale gr/gr. In un recente studio di popolazione dell’Italia centrale i portatori di delezioni parziali gr/gr hanno un rischio 7,9 maggiore di avere una compromissione della spermatogenesi paragonati agli uomini che non hanno questa delezione. I dati pubblicati recentemente dimostrano come , seppur senza un drastico effetto sul fenotipo , le delezioni parziali gr/gr siano un cofattore che porta alla compromissione della spermatogenesi. Inoltre , dato che questo difetto genetico è trasmesso alla prole maschile, è importante la consulenza genetica per informare la coppia circa la trasmissione di una predisposizione alla produzione di spermatozoi danneggiati. Il kit AMPLI CROMOSOMA Y gr/gr. permette di identificare la presenza delle delezioni parziali gr/gr effettuando una PCR che utilizza primers specifici per la sY1291 e sY1191 e per la β -globina, quale controllo interno della multiplex PCR di 720 bp. La mancanza di amplificazione della sY1291 indica la presenza della delezione parziali gr/gr.

Principio del metodo:

A) estrazione del DNA genomico B) amplificazione C) rivelazione sul gel di agarosio.

Applicabilità:

Su DNA genomico estratto e purificato da campioni di sangue intero e liquidi biologici.

Numero di Test:

24.

CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE

AMPLIFICAZIONE M-PCR mix H 2 O sterile Taq Polymerase (5U/  l)

-20°C -20°C -20°C

Controllo DNA maschio normale

-20°C

Stabilità:

superiore a 12 mesi se correttamente conservato.

Materiali Richiesti:

tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro); Portaprovette refrigerato; tubi PCR.

Reagenti richiesti non compresi nel kit:

acqua bidistillata sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.

Strumenti richiesti:

centrifuga con rotore ad angolo fisso per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g), Set di pipette pre-PCR e post-PCR (0.5 – 20  l, 10 – 100  l, 20 – 200  l, 200 – 1000  l); Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase e RNase free e monouso. Rappresentazione schematica del cromosoma Y e il modello attualmente accettato delle microdelezioni. (Repping et al. 2002). Sequenze ripetute (palindrome con codice colore) spiegano l’origine delle microdelezioni nella regione AZFbc dovuta alla ricombinazione omologa tra sequenze identiche. La posizione dei primers per gli STS suggerita da EAA/EMQN 2013 è indicata dalle linee tratteggiate. Dato che 4 copie del gene DAZ sono normalmente presenti sul cromosoma Y, i primers per STS sY254, sY255 amplificano 4 loci in AZFc. La delezione AZFc(b2b4) è la più frequente (~80%) delle microdelezioni presente negli uomini con severa oligospermia.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

La reazione di multiplex PCR dopo corsa elettroforetica su gel di agarosio nusive 3%, darà i seguenti prodotti di amplificazione: SY1191= 385bp SY1291= 527bp, controllo interno multiplex PCR

β

-globina 641bp.

7 6 5 4 3 2 1

REFERENZE:

der Veen F, Page DC,Rozen S. Genet. 2003 Nov;35(3):247-51. 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 008-0561-1. Epub 2008 Sep 21. Review. PubMed PMID: 21422806 ladder 100 bp; campione maschio normale; campione deleto per sY 1291; campione deleto per sY 1291; campione maschio normale; campione deleto per sY 1291; controllo maschio normale. 1. Repping S, Skaletsky H, Brown L, van Daalen SK, Korver CM, Pyntikova T,Kuroda-Kawaguchi T, de Vries JW, Oates RD, Silber S, van Polymorphism for a 1.6-Mb deletion of the human Y chromosome persists through balance between recurrent mutation and haploid selection. Nat 2. Giachini C, Laface I, Guarducci E, Balercia G, Forti G, Krausz C. Partial AZFc deletions and duplications: clinical correlates in the Italian population. Hum Genet. 2008 Nov;124(4):399-410. doi: 10.1007/s00439 3. Krausz C, Chianese C, Giachini C, Guarducci E, Laface I, Forti G. The Y chromosome-linked copy number variations and male fertility. J Endocrinol Invest. 2011 May;34(5):376-82. doi: 10.3275/7612. Epub 2011 Mar 21. REV. 01 4. Skaletsky H Kuroda-Kawaguchi Y, Minx PJ, Cordum Hs et The male– specific region of thje human Y chromosome is a mosaic of discrete sequences classes. Nature 2003 423:825-837. REV. 01