Transcript Eugenie Grandet

FLUORESCENZA
• La FLUORESCENZA è un processo di emissione di luce a seguito
del rilassamento di uno stato elettronico eccitato generato da un
assorbimento di luce.
L’assorbimento di luce da parte di una molecola, corrisponde ad un
assorbimento di energia che promuove un elettrone da uno stato
fondamentale ad uno stato eccitato (singoletto eccitato).
Una volta eccitata elettronicamente una molecola torna al più basso stato
eccitato attraverso una serie di rilassamenti vibrazionali e rotazionali che
dissipano energia senza emissione di luce (conversione interna).
Le transizioni elettroniche
(Diagramma di Jablonsky)
S0 è lo stato fondamentale e S1 e S2 sono gli stati elettronici
eccitati, entranbi con 4 stati vibrazionali eccitati.
L’irradiazione di una specie molecolare
ipotetica produce l’eccitazione delle
popolazioni elettroniche dal livello S0 a
quello eccitato S1 (o S2).
Fluorescenza
Assorbimento
Una volta che la molecola è eccitata a
S1 o S2 possono avvenire diversi
processi attraverso i quali la molecola
perde il suo eccesso di energia.
Due dei più importanti meccanismi di
questo tipo sono il rilassamento non
radiativo (processi di rilassamento
vibrazionali e di conversione interna)
e
il
rilassamento
attraverso
fluorescenza.
In altre parole:
una volta avvenuta l’eccitazione elettronica, l’elettrone può rilasciare
l’energia acquisita,
o sotto forma di calore, o attraverso processi
dinamici della molecola che coinvolgono assorbimento di energia.
Ma l’elettrone può anche cedere l’energia mediante
processi radiativi, uno di questi fenomeni è la
FLUORESCENZA.
Gli elettroni coinvolti nella transizione di fluorescenza sono generalmente
elettroni π.
Composti aromatici (con elettroni π delocalizzati) spesso sono fluorescenti.
Spettri di assorbimento ed emissione
• I fenomeni di disattivazione non radiativa dissipano l’energia accumulata
dallo stato eccitato.
• L’emissione avverrà quindi ad energia più bassa (maggiore lunghezza
d’onda).
• La differenza in energia è detta “Stokes’ shift”. E = hν; ν = c/λ
Stokes Shift is 25 nm
Fluorescein
molecule
Fluorescence Intensity
495 nm
Wavelength
520 nm
Tutte le molecole assorbenti possono potenzialmente
fluorescere, anche se la maggior parte dei composti
non
lo
fa
meccanismi
perché
non
rilassamento
la
propria
radiativi
avviene
ad
struttura
medianti
una
i
velocità
prevede
quali
il
maggiore
dell’emissione fluorescente.
Generalmente, composti contenenti anelli aromatici o
strutture
coniugate
caratterizzati
da
una
certa
rigidità strutturale danno l’emissione di fluorescenza
molecolare più intensa.
Processi radiativi e non-radiativi
• Oltre a conversione interna ed intersystem crossing, altri processi, non radiativi,
competono con la fluorescenza (processo radiativo).
• In soluzione questi processi “impoveriscono” lo stato eccitato in modo non radiativo,
quindi:
IL NUMERO DI FOTONI EMESSI È MINORE
DEL NUMERO DI FOTONI ASSORBITI
Il quantum yield (Qf, rendimento quantico, efficienza quantica) di una molecola è
definito come:
Qf = Numero di fotoni assorbiti/Numero di fotoni emessi
0 ≥ Qf ≤ 1
L’INTENSITA’ di Fluorescenza (proporzionale alla Qf) è proporzionale
alla concentrazione del fluoroforo (in particolare a bassa concentrazione).
Fluorescenza:
vantaggi
• Sensibilità
• Selettività
• Relazione semplice tra
If e concentrazione
Fluorescenza:
svantaggi
• Non si può prevedere con
certezza se una molecola è
fluorescente
• Dipendenza dalle condizioni
ambientali
• “Effetto-filtro” ad alte
concentrazioni
Quenching: decadimento dallo stato eccitato mediante fenomeni di conversione interna
o per interazione con molecole in soluzione che non porta alla emissione di radiazioni
luminose.
Photobleaching: se una sonda fluorescente viene esposta al lampo di una radiazione ad
alta intensità può essere completamente “sbiancata”, facendole perdere in modo
permanente la capacità di emettere fluorescenza.
Alcuni materiali biologici, soprattutto vegetali, come la
cellulosa,
colpiti
da
radiazione
U.V.
emettono
naturalmente fluorescenza.
Si parla di:
fluorescenza primaria o autofluorescenza
La maggior parte dei campioni biologici però, emette
fluorescenza solo dopo marcatura con fluorocromi.
In tal caso si parla di:
fluorescenza secondaria o indotta
FLUOROFORI INTRINSECI
Fluorescenza intrinseca di proteine
• Triptofano
– Il più efficiente ed il più usato,
– A secondo del suo intorno chimico varia il suo spettro.
• Tirosina
– Può esistere come tirosinato.
– Può dare energy transfer con il triptofano
• Fenilalanina
- …….
(difficile).
La GFP:
Green Fluorescent Protein
La “famiglia” della GFP
GFP, CFP, YFP sono varianti di colore derivanti da
mutazioni nei residui aminoacidici della GFP.
Molecole fluorescenti usate in biologia
Tradizionali
Alexa Fluor
Cyanine
Sonde per gli ioni calcio Ca2+
• Vecchia generazione: Fura-2, Indo-1, Fluo-3
• Nuova generazione: CAMELEON
Sonde fluorescenti per proteine
Dansile
(e derivati: EDANS; IAEDANS)
– Usato per fare il “labelling” covalente di
proteine al gruppo amminico;
– Usati per FRET.
ANS
(1-anilino-naftalen-8-sulfonato)
– Usato per studiare il “moltenglobule state”.
Si lega in modo non covalente preferibilmente
ai domini idrofobici delle proteine.
– In ambiente idrofobico è più fluorescente
che in acqua.
MICROSCOPIA IN FLUORESCENZA:
applicazioni
• Colocalizzazione
• Espressione di proteine fluorescenti (GFP, BFP, YFP, CFP,dsRFP…)
• Photoconversion
• Funzione, distribuzione e modificazione della proteina di interesse
con anticorpi marcati
• Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
• Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) e Fluorescence
Recovery After Photobleaching (FRAP)
• Quenching
• Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
• Microscopia multifotonica
• Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
Fluorescent
Microscope
Arc Lamp
La sorgente di luce del microscopio a fluorescenza è di solito una
lampada a globo di quarzo contenente vapori di mercurio ad alta
pressione, alloggiata in un portalampada che ne permette il
raffreddamento. Si possono anche utilizzare lampade allo xenon o
ad alogeni.
Excitation Diaphragm
Excitation Filter
Nel microscopio a fluorescenza sono presenti due sistemi di filtri.
filtri. Il
filtro di eccitazione lascia passare solo le lunghezze d’
d’onda utili per
l’eccitazione della fluorescenza, mentre il filtro di sbarramento (o di
emissione) trattiene la radiazione non assorbita e lascia passare solo la
luce dovuta alla fluorescenza.
Emission Filter
Risoluzione 200nm
Objective
Ocular
SPETTRO DI EMISSIONE DELLA
LAMPADA A MERCURIO
SPECCHI DICROICI
Hg
A: filtro di eccitazione (luce “monocromatica”)
B: ripartitore dicroico
C: filtro di sbarramento
Non sempre è possibile marcare “gli oggetti” che vogliamo
osservare (proteine o altre biomolecole), legandoli direttamente a
fluorofori.
Uso di molecole “sonda” costituite da particelle non fluorescenti
che a loro volta si legano selettivamente alle molecole da
osservare.
Immunofluorescenza:
La sonda flurescente viene legata a specifici anticorpi, che a loro
volta si legano selettivamente al proprio antigene
La microscopia in fluorescenza non ha lo scopo di migliorare il potere di
risoluzione, ma permette di localizzare, in cellule o tessuti, molecole marcate
con particolari sostanze dette fluorocromi..
Cosa si può vedere con un
microscopio a fluorescenza:
Blu:
DAPI legato al DNA.
Rosso:
anticorpo fluorescente
legato al centromero.
Verde: Anticorpo fluorescente
legato alla tubulina.
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
Nuclei DAPI
Nuclei FITC
(365 nm)
(404 nm)
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA NELLA
DIAGNOSTICA CLINICA
Fluorescenza
nucleare
Fluorescenza
mitocondriale
Fluorescenza
ribosomiale
Cellule Hep-2
Tubuli renali
Cellule Hep-2
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
• Non permette di eccitare in modo distinto due o più
fluorocromi presenti contemporaneamente nel preparato
• Non permette di ottenere informazioni da piani
discreti del preparato. L’immagine riprodotta
corrisponde alla sovrapposizione degli elementi
presenti lungo l’intero asse Z del campo
osservato
Microscopia
Confocale
Laser
Excitation Pinhole
La luce di un laser viene fatta convergere dalle lenti dell'obbiettivo
dell'obbiettivo in
un punto estremamente piccolo del campione osservato
Excitation Filter
Il punto di focalizzazione, attraverso un sistema di
specchi oscillanti, viene spostato attraverso tutto il
campo visivo dell'obbiettivo così da effettuare una
scansione completa di tutto il piano focale.
PMT
Objective
La luce emessa dai fluorocromi presenti nel
campione
viene
catturata
dalle
lenti
dell'obbiettivo e deviata da uno specchio
dicroico su un fotomoltiplicatore, che
trasforma l'intensità luminosa rilevata in un
segnale elettrico di intensità proporzionale.
Emission
Filter
Emission Pinhole
Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore, il fascio luminoso attraversa un diaframma (o pinhole),
che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco di raggiungere il fotomoltiplicatore.
Nella MICROSCOPIA CONFOCALE:
9 Solo il segnale luminoso relativo al piano di fuoco viene registrato e
utilizzato nella formazione dell'immagine finale.
9 Le caratteristiche della luce laser (estrema coerenza, alta intensità e
lunghezza d'onda unica) consentono di evitare fenomeni di aberrazioni e
diffrazioni tipiche invece della luce prodotta da tradizionali lampade a
incandescenza.
9 Le lenti dell'obbiettivo fanno sì che l'intensità della luce laser sia
sufficiente
a
concentrazione
eccitare
del
i
raggio,
fluorocromi
soltanto
corrispondente
al
nel
piano
punto
di
di
massima
messa
a fuoco
dell'obbiettivo (le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, non venendo
eccitate, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la
formazione di aloni e riducendo il “rumore di fondo”).
Possibilità di scansionare sequenzialmente il
campione per una ricostruzione
tridimensionale
Ricostruzione 3D dell’immagine
# z sections =#images
y
z
x
L’insieme dei dati ottenuti con un microscopio confocale è simile ad un libro. Un libro ha
molte pagine ed ogni pagina mostra le informazioni solo se viene letta. Leggere una pagina
in un libro è come fare una scansione con un microscopio confocale!
Lo spessore “piano Z” analizzato al microscopio confocale è direttamente proporzionale
all’apertura del pinhole, tuttavia non è possibile ridurre quest’ultima oltre certi limiti.
Spessore minimo valutabile = 0,60 – 1,2 µm
Vantaggi della microscopia confocale rispetto alla
microscopia convenzionale
Permette di eccitare in
modo specifico un dato
fluorocromo
• Ridotta profondità di campo vista l’alta
intensità e coerenza della luce laser
• Migliore risoluzione e contrasto
Permette
di
selezionare il
fuoco relativo
ad una sezione
del preparato
• Aumentata risoluzione sui 3 assi XYZ
• Sezionamento ottico XY e Z (evita la
preparazione di sottili sezioni e
permette
di
effettuare
una
ricostruzione 3D del campione)
• Permette di lavorare su cellule vive (si
evitano gli artefatti di fissazione e
inclusione)
L’attuale velocità dei calcolatori infatti permette di risolvere non soltanto spazialmente ma anche
temporalmente il segnale di fluorescenza.
Lo stesso strumento adoperato per ottenere immagini ad alta risoluzione può essere anche utilizzato per
“inseguire” le molecole fluorescenti.
SCANSIONI SEQUENZIALI LUNGO
L’ASSE Z
MICROSCOPIO CONFOCALE
PINHOLE APERTO
PINHOLE CHIUSO
(~ MICROSCOPIO A
FLUORESCENZA)
(1 Airy unit)
COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI
A livello del fotomoltiplicatore viene riprodotta l’immagine del campione
analizzato, se ad uno stesso pixel arriva la radiazione luminosa proveniente
da due diversi fluorocromi il colore registrato deriverà dalla “fusione” dei
colori appartenenti ai fluorocromi in esame
(es: rosso + verde = giallo,
blu + rosso = viola …)
Tuttavia affinchè la presenza di un colore “da fusione” rappresenti realmente
la colocalizzazione spaziale di due molecole marcate da due
diversi
fluorocromi e non la semplice sovrapposizione di molecole dotate delle stesse
coordinate X Y ma di diverse coordinate Z (sovrapposizione di più piani
focali), è indispensabile che venga analizzato un singolo piano focale.
COLOCALIZZAZIONE APPARENTE
PINHOLE APERTO:
SCANSIONE DI UN “SINGOLO PIANO”
FOCALE A LIVELLO EQUATORIALE
SOVRAPPOSIZIONE DI TUTTI I PIANI
FOCALI PRESENTI NEL PREPARATO
(SPESSORE 0,64 µm PER FITC, VERDE
SPESSORE 0,81 µm PER PI, ROSSO)
COLOCALIZZAZIONE DI MOLECOLE
Antigene di membrana
Antigene X
Antigene di membrana
+
Antigene X
COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI
Intercalante del DNA
GATA-3
IL-4
COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI
VARIANTE DI
MEMBRANA
PROTEINA
CLASSICA
COSTRUTTO GFP
CONCANAVALINA
SOVRAPPOSIZIONE
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer
OVVERO
trasferimento di energia da un composto fluorescente
donatore ad uno accettore
FRET: fenomeno che si verifica quando due distinti cromofori
(donatore ed accettore) con spettri di assorbimento/emissione
parzialmente sovrapposti, sono separati, con un corretto
orientamento, da una distanza di 10-80 Angstroms.
I principi della tecnica furono definiti intorno agli anni ’50….
Solo con l’introduzione delle FP (fluorescent protein) e della
microscopia in fluorescenza, la tecnica ha cominciato ad assumere
importanza per lo studio delle interazioni proteina-proteina e dei
cambiamenti conformazionali delle proteine in vivo.
• Il trasferimento non è legato ad
emissione di tipo radiativo da parte
donatore, non richiede collisione e
determina produzione di calore.
una
del
non
• Il
TRASFERIMENTO
DI
ENERGIA
avviene per risonanza (accoppiamento
dipolo-dipolo),
purchè
vi
sia
una
sovrapposizione tra lo spettro di
fluorescenza del donatore e
quello
di
assorbimento
dell’
accettore.
• Il trasferimento non è influenzato
dall’effetto dissipativo del solvente in
quanto avviene a distanza molto ravvicinata
tra i due fluorofori.
Le due molecole devono
essere “molto vicine”
(<100 angstroms) e il
loro orientamento
reciproco deve essere
“appropriato”
La distanza a cui si ha il
50%
di
trasferimento
energetico, viene definita
come:
“DISTANZA CRITICA DI
FORSTER” (R0).
Ogni coppia di fluorofori ha
il suo valore di R0.
Da cosa dipende il trasferimento di energia
•
Sovrapposizione degli spettri di emissione e di assorbimento di donatore e
accettore;
•
Distanza tra i due fluorofori rispetto alla “distanza critica di Forster R0”
(1≤ r ≤10nm);
•
Quantità di energia trasferita ed efficienza di trasferimento (correlate alla
vita media dell’ emissione di fluorescenza del donatore e dell’accettore);
•
Orientamento dei dipoli nello spazio;
•
Indice di rifrazione del mezzo;
•
Rendimento quantico (Qf = n°fotoni assorbiti/n° fotoni emessi).
Il fenomeno di trasferimento può essere evidenziato sia tramite rilevamento
dell’emissione dell’accettore, dopo aver eccitato il donatore con l’opportuna
lunghezza d’onda, sia valutando il decadimento della fluorescenza del donatore in
presenza e assenza dell’accettore (= EFFICIENZA DI TRASFERIMENTO).
LA QUANTITÀ DI ENERGIA TRASFERITA È DEFINITA COME:
KT = (1/τD) • [R0/r]6
Quantità di energia trasferita
L’EFFICIENZA DI TRASFERIMENTO è DEFINITA COME:
ET = 1 - (τDA/τD)
Efficienza di trasferimento
oppure
τ(D) vita media della emissione di fluorescenza del donatore
τ(DA) vita media della emissione di fluorescenza del donatore
in presenza dell’
dell’accettore
ET = 1/[ 1+(r/R0)6 ]
Efficienza di trasferimento
È FONDAMENTALE CONOSCERE LA DISTANZA CRITICA DI FORSTER Ro,
OVVERO LA COPPIA DONATORE/ACCETTORE:
J(λ)
(λ) “Sovrapposizione degli spettri di emissione e
di assorbimento di donatore e accettore”
accettore”
R0 = 2.11 x 10-2 • [κ2 • J(λ) • η-4 • QD]1/6
Distanza critica di Forster
K2
Orientamento dei dipoli nello spazio
η
Indice di rifrazione del mezzo
QD
rendimento quantico del donatore in
assenza dell’
dell’accettore
ET = 1/[ 1+(r/R0)6 ]
Efficienza di trasferimento
La distanza di Forster è la
distanza a cui si ha il 50% di
Efficienza di Trasferimento!
Alcuni esempi
Donor
Acceptor
Förster Distance
(Nanometers)
Tryptophan
Dansyl
2.1
IAEDANS (1)
DDPM (2)
2.5 - 2.9
BFP
DsRFP
3.1 - 3.3
Dansyl
FITC
3.3 - 4.1
Dansyl
Octadecylrhodamine
4.3
CFP
GFP
4.7 - 4.9
CF (3)
Texas Red
5.1
Fluorescein
Tetramethylrhodamine
4.9 - 5.5
Cy3
Cy5
>5.0
GFP
YFP
5.5 - 5.7
BODIPY FL (4)
BODIPY FL (4)
5.7
Rhodamine 6G
Malachite Green
6.1
FITC
Eosin
Thiosemicarbazide
6.1 - 6.4
B-Phycoerythrin
Cy5
7.2
Cy5
Cy5.5
>8.0
(1)
(2)
(3)
(4)
5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleimide
carboxyfluorescein succinimidyl ester
4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
La GFP: Green Fluorescence Protein
La GFP è stata la prima proteina fluorescente (da Aequorea victoria)
ad essere clonata (1992)
La sua struttura cristallina fu risolta nel 1996:
9 Barile β con fluoroforo al
centro
9 La
struttura
a
barile
costituisce
una
barriera
di
protezione per il fluoroforo, che
risulta
stabile
in
svariate
condizioni.
• Massimi di eccitazione a 395 e 470 nm (resa quantica = 0.8)
• Picco di emissione a 509 nm
• L’applicazione principale è come gene reporter in Biologia Molecolare
• Non richiede l’aggiunta di substrati
FRET e GFP
La GFP:
9 Può essere espressa in un’ampia varietà di cellule;
9 La sua fluorescenza è spontanea e non ha bisogno di cofattori;
9 Può essere “fusa” con proteine “di interesse”; le proteine di
fusione solitamente mantengono sia la fluorescenza della GFP che
le funzioni biochimiche della proteina di interesse;
9 Aggiungendo appropriati “peptidi segnale”, le proteine di fusione
possono essere direzionate verso specifici organelli;
9 Per mutagenesi sono state prodotte forme della GFP con
proprietà spettrali differenti
FRET
IL fluoroforo della GFP proviene da una modificazione
post-trascrizionale della proteina
Condensazione di tre amminoacidi (Ser, Tyr, Gly)
GFP, CFP, YFP sono varianti di colore
aminoacidici della GFP.
derivanti da mutazioni nei residui
L’uso di proteine di fusione con la GFP o le sue varianti, ha
permesso di visualizzare la localizzazione cellulare simultanea di
molte proteine……
L’esistenza delle “varianti di colore” della GFP ha reso possibile sfruttare
il fenomeno “FRET” per studi in vivo di interazione proteina-proteina.
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer
OVVERO
trasferimento di energia da un composto fluorescente donatore ad uno accettore
Applicazioni
a)
Variazione della distanza di
due siti della stessa molecola
b)
Interazione
diverse
tra
molecole
(a) Intramolecular FRET can occur when both the
donor and acceptor chromophores are on the same
host molecule, which undergoes a transition, for
example,
between
‘open’
and
‘closed’
conformations. In each square box corresponding
to CFP or YFP (shown in cyan or yellow,
respectively), a diagonal line represents the
chromophore. The amount of FRET transferred
strongly depends on the relative orientation and
distance between the donor and acceptor
chromophores: the parallel orientation and the
shorter distance (<100 Å) generally yield larger
FRET. (b) Intermolecular FRET can occur between
one molecule (protein A) fused to the donor (CFP)
and another molecule (protein B) fused to the
acceptor (YFP). When the two proteins bind to
each other, FRET occurs. When they dissociate,
FRET diminishes.
FRET imaging microscopy experiment
In FRET experiments, a single transfection
(intramolecular
FRET)
or
co-transfection
(intermolecular FRET) of the constructs must
first be performed. The occurrence of FRET
can be observed by exciting the sample at the
donor excitation wavelengths while measuring
the
fluorescence
intensities
emitted
at
wavelengths corresponding to the emission
peaks of the donor versus those of the
acceptor. If the acceptor and donor are at a
favorable distance and orientation, donor
emission intensity decreases (CFP, cyan) while
the acceptor emission (YFP, yellow) intensity
increases.
FRET intramolecolare:
BFP- peptide linker con sito di taglio per Fattore Xa-GFP
BFP- peptide linker con sito di taglio per tripsina-GFP
BFP- peptide linker con sito di taglio per caspasi 3-GFP
CFP- peptide linker con sito di taglio per caspasi 3-YFP
R.D. Mitra et al.,
Gene (1996)
R. Heim and R.Y. Tsien,
Curr Biol (1996)
X. Xu, et al.,
Nucleic Acids Res(1998)
K.Q. Luo,et al.,
Biochem Biophys Res Commun (2001)
Altri lavori:
studi sul trasporto del Ca2+ ; sulla segnalazione AMPc-dipendente; sulla
segnalazione da TKR…..
FRET intermolecolare:
Più complessa da studiare!
9 La stechiometria fra donatore ed accettore può variare con l’efficienza di
trasfezione
9 Le proteine di fusione in vivo possono avere capacità di interazione ridotte
9 La distanza e l’orientamento fra donatore ed accettore possono non
essere “favorevoli”, indipendentemente dalla capacità delle due proteine di
interesse di formare un complesso
NON NECESSARIAMENTE DEVONO ESSERE USATE PROTEINE DI
FUSIONE CON FP….
Un esempio…
Come si misura:
Filtri sul detector che rivelano solo l’emissione del donatore o
dell’ accettore (non sempre sono così selettivi)
Fattori determinanti
•
Concentrazione del donatore e dell’accettore
•
Evitare photobleaching
•
Scelta delle coppie donatore-accettore (sovrapposizione degli spettri,
λ di eccitazione dei due fluorofori, tempo di vita della fluorescenza
del donatore )
•
Sensibilità del detector e dei filtri dello strumento
•
Legame fluoroforo-anticorpo e sua specificità
•
Localizzazione di proteine di fusione con FP
Bioluminescence Resonance Energy
Transfer - BRET
Il primo dei due partner è fuso con la
luciferasi da Renilla e il secondo con una
proteina fluorescente (YFP). La luciferasi
è attivata dal suo substrato naturale
(celenterazina). Se le due molecole non
interagiscono può essre rilevato solo il
segnale emesso dalla luciferasi, mentre
se c’è interazione può avvenire un
trasferimento di energia tra la luciferasi
e la YFP portando all’emissione di un
segnale fluorescente da parte di
quest’ultima. Il trasferimento di energia
avviene se la luciferasi e la YFP si trovano
ad una distanza minore di 100Å.
FRAP
Fluorescence Recovery After Photobleaching
Photobleaching: se una sonda fluorescente viene esposta al lampo di una
radiazione ad alta intensità può essere completamente “sbiancata”,
facendole perdere in modo permanente la capacità di emettere
fluorescenza.
•
Donor photobleaching fluorescence resonance energy transfer
(pbFRET): un fluoroforo è sensibile al photobleaching solo quando è in
uno stato eccitato ⇒ se c’e trasferimento diminuisce il fenomeno
(rispetto all’assenza dell’accettore).
•
Acceptor photobleaching: il quenching sull’emissione del donatore è
valutato in presenza o meno di photobleaching sull’accettore.
Fluorescence Recovery After Photobleaching
Si usa una energia intensa (laser) per eccitare ed
“esaurire” un fluoroforo
Si osserva la zona “buia” (foto-sbiancata) nel
tempo...
La fluorescenza ricompare nella regione “sbiancata”
I dati mostrano la velocità di diffusione dei
recettori nell’area