Transcript Djinn : ce qui est caché

EPN
FACILE DA DIMENTICARE,
IMPOSSIBILE DA IGNORARE
Cos'è l'EPN?
E’ una malattia clonale,non
neoplastica
Cos'è l'EPN?
• L'EPN è una malattia caratterizzata da emolisi cronica
mediata dal complemento e da una mutazione somatica
(acquisita) del gene PIG-A, in cui le cellule ematiche sono
carenti di cruciali inibitori del complemento distale (per
es. CD55 e CD59) naturalmente presenti sulle superfici
delle cellule1-4
– Tale mutazione determina un'eliminazione delle ancore GPI,
rendendo le proteine incapaci di agganciarsi alla superficie
della cellula
• L'EPN è una malattia progressiva e distruttiva, che causa:
– Trombosi5
– Danni d'organo1,6
– Incremento della mortalità1,7
1. Brodsky R. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. In: R Hoffman et al., eds. Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. Philadelphia, PA: Elsevier Churchill
Livingstone 2005;419–427; 2. Rosse WF et al. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 2004:48–62; 3. Wiedmer T et al. Blood 1993;82:1192–1196; 4. Rother
RP et al. JAMA 2005;293:1653–1662; 5. Hillmen P et al. Blood 2007;110:4123-4128; 6. Hillmen P et al. Am J Hematol 2010;85:553–559; 7. Hillmen P et al. N Engl J
Med 1995;333:1253–1258.
L'EPN: cosa non è
• Non è parossistica1
– Anche in assenza di sintomi, l'emolisi progredisce
costantemente in maniera distruttiva
• Non è notturna1
– L'emolisi nell'EPN agisce in maniera subdola e
costante, 24 ore su 24
• L'emoglobinuria è una complicazione
meno frequente
– ¾ dei pazienti non presenta emoglobinuria2
1. Rother R et al. Nature Biotechnology 2007;25,11:1256–1264; 2. International PNH Interest Group. Blood. 2005;106:3699–3709.
PNH IS 5-10 TIMES LESS FREQUENT THAN APLASTIC ANAEMIA.
BOTH ARE MORE FREQUENT IN SOUTH EAST ASIA
TWO COMPONENTS
IN THE PATHOGENESIS OF PNH
1. An expanded population of GPI(-) blood
cells belonging to a PIG-A mutant
clone(s)
2. Failure of normal hematopoiesis
Pathogenesis of PNH
(Rotoli & Luzzatto, 1989)
Time
PIG-A plus
blood cell
PIG-A minus
blood cell
PIG-A plus
damaged blood cell
Noxious agent
Il difetto nell'EPN
I cloni EPN sono definiti come cellule EPN con un deficit nelle proteine che
richiedono un'ancora GPI per agganciarsi alla membrana cellulare1
CD59 (MIRL)
CD55 (DAF)
• Ha la funzione di creare uno scudo che
protegge i globuli rossi (RBC) dalla lisi
mediata dal complemento
• Inibisce il montaggio del complesso di
attacco alla membrana
• Impedisce la formazione e
incrementa l'instabilità della C3
convertasi, attenuando la cascata del
complemento
CD59
Ancora GPI
CD55
GPI = glicosil-fosfatidil-inositolo.
1. Borowitz MJ et al. Cytometry B Clin Cytom 2010;78:211–230.
Adattamento da: Johnson RJ et al. J Clin Pathol: Mol Pathol 2002;55:145–152; Brodsky R. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. In: R Hoffman et al, eds. Hematology Basic Principles and Practices. 4th ed. Philadelphia, PA: Elsevier Churchill Livingstone; 2005;419–427.
È necessario che si verifichi un'espansione del clone
EPN perché vi sia riscontro di un'EPN clinica
Fase 1
Mutazione
somatica
del gene PIG-A
Fase 2
Attacco
immunologico
Danno selettivo
Cellula con deficit di
GPI
Cellule staminali
ematopoietiche
normali
•
•
Deficit nell'ancora
GPI
Fase 3
Vantaggio
di crescita
Cellule selezionate
Selezione
immunologica
Cellule espanse
Espansione benigna
simil-tumorale
L'espansione può essere dovuta a un'altra mutazione somatica
Il fatto che sia necessaria sia una selezione sia un'espansione spiega probabilmente la rarità dell'EPN
Adattamento da: Inoue N et al. Int J Hematol 2003;77:107.
PAROXYSMAL NOCTURNAL HAEMOGLOBINURIA:
definition
Haemolytic anaemia
with characteristic clinical triad:
1. Intravascular haemolysis
2. Thrombosis
3. Cytopenias
A chronic disorder
PROTEINS DEFICIENT ON PNH BLOOD CELLS
CD55
CD58*
CD59
PrPC
AChE
JMH Ag
Dombroch
HG Ag
CD55
CD58*
CD59
CD109
PrPC
GP500
Gova/b
CD24
CD58*
CD48
B cells
RBC
Hematopoietic
Stem Cell
T cells
CD59, CD90, CD109
CD55
CD59
CDw52
CDw108
ADP-RT
CD90
CD16*
CD55
CD59
PrPC CD73
CDw108
CD58*
CD48
CD87
PrPc
CD73
CD109
Platelets
NK cells
CD55
CD59
CD16
CD48
CD66c
CD109
LAPNB1
p50-80
ADP-RT
CD58*
CD14
CD24
CD66b
CD87
CD157
PrPC
GPI-80
NA1/NA2
Monocytes
PMN
CD14
CD59
CD87
Group 8
CD16*
CD55
CD48
CD109
PrPC
CD58*
CDw52
CD157
GPI-80
CD55
CD58*
CD59
CD48
CDw52
PrPc
CD16*
All these proteins are GPI-linked
QuickTime™ and a
GIF decompressor
are needed to see this picture.
PNH
• CAN AFFECT ALL POPULATIONS
THROUGHOUT THE WORLD
• ALL AGES AND SOCIOECONOMIC GROUPS
• NEVER REPORTED AS CONGENITAL
• NO FAMILY CLUSTERING
• IT IS AN ACQUIRED DISEASE
Classification of PNH
Definition
Classic PNH
PNH in the setting of
other BM disorders
Subclinical PNH
Haemolysis
BMF
+
+
+
-
+
Diagnosis cytometric
•PNH I
•PNH II
Normal cells
Partial deficiency
•PNH IIIComplete deficiency
PAROXYSMAL NOCTURNAL HAEMOGLOBINURIA:
CLASSIFICATION
A. Florid haemolytic
B. PNH/Aplastic Anaemia syndrome
C. Sub-clinical
CLINICAL BURDEN OF PNH
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Chronic anaemia (puo’ non esserci)
Impending risk of thrombosis
Possible consequences of cytopenias
Attacks of abdominal pain
Dysphagia
Pulmonary hypertension
Renal failure
Erectile dysfunction
Problems in pregnancy
Trombosi
La trombosi è la principale causa
di morte nei pazienti con EPN1
• Rappresenta il 40–67% delle cause di morte2
– Il primo evento trombotico (ET) può essere fatale2,3
– Il primo ET aumenta il rischio di morte di 5-10 volte2
• Il 44% di pazienti sviluppa eventi trombotici
clinici2
• Si verifica in sedi tipiche e atipiche4
• Non è adeguatamente gestita con
l'anticoagulazione2
• Tutti i pazienti con EPN sono a rischio di
trombosi2
1. International PNH Group et al. Blood 2005;106:3699–3709; 2. Hillmen et al. Blood 2007;110:4123–4128;
3. Audebert HJ et al. J Neurol 2005;252:1379–1386; 4. Lee JW et al. Hematologica 2010;95(s2): Abstract 506
La trombosi si verifica sia in sedi
tipiche sia in sedi atipiche*
Trombosi
Trombosi venosa superficiale
Trombosi
cerebrale/giugulare
interna
Embolo polmonare
Trombosi epatica/
vena porta
VENOSA
5.6
13.7
Infarto miocardico/
1.6 angina instabile
ARTERIOSA
13.7 Evento
cerebrovascolare/attacco
ischemico transitorio
6.5
33.1 Trombosi venosa profonda*
16.9
18.5 Trombosi mesenterica/della vena splenica
*124 eventi, 63 pazienti
*Comprende il 18,5% a livello delle estremità inferiori e il 14,5% di altro tipo (vena cava inferiore, estremità inferiore bilaterale, vene
pelviche, vene uretrali, vene ascellari, vene succlaviali, e vene brachiocefaliche).
Malattia renale cronica
Malattia renale nell'EPN
• L'insufficienza renale è stata identificata come
la causa di morte per circa l’8 – 18% dei
pazienti con EPN1
• La malattia ai reni nell'EPN è causata
dall'emolisi mediata dal complemento2,3
• Il 64% dei pazienti con EPN accusa in un dato
momento una malattia renale cronica4
• La malattia ai reni è sottovalutata nell'EPN4
1. Nishimura JI et al. Medicine 2004;83:193–207; 2. Clark DA et al. Blood 1981;57:83–89; 3. McKeage K. Drugs 2011;71:2327–2345;
4. Hillmen P et al. Am J Hematol 2010;85:553–559; 5. Kim JS et al. Hematologica 2011;96(s2): Abstract 271.
Sintomi comuni dell'EPN
I sintomi comuni hanno un impatto
significativo sulla QdV
Affaticamento
97
Cefalea
76
Dispnea
66
Dolore all'addome
59
Emoglobinuria
n=29
55
Disfunzione erettile
47
0
20
40
60
80
100
120
Pazienti (%)
La maggioranza dei pazienti ha evidenziato sintomi da moderati a molto gravi
Il 59% dei pazienti per almeno 12 mesi non ha avuto trasfusioni o non ha mai avuto trasfusioni
Il 76% è stato forzato a modificare le proprie attività quotidiane per gestire l'EPN
Il 17% ha perso il lavoro a causa dell'EPN
Weitz I et al. J Intern Med 2012.
• Fine novembre 2009 il Sig.C.GP. 68 anni, si reca al CT
per una trasfusione
• Validazione esami: G6PDH ???
• anemia macrocitica (Hb:9.1),reticolocitosi
(10%),aptoglobina bassa,LDH:5362,
bilirubina ind .1.78 ,Coombs neg:anemia emolitica
.colloquio con medico del Centro Trasfusionale:
aprile 2005 ematologia Genova:aplasia midollare
idiopatica
.lezione magistrale del Prof.Luzzato:EPN
.Immunofenotipo:conferma il sospetto diagnostico
Segni e sintomi per la diagnosi
Internista ed Ematologo
•
•
•
•
Anemia emolitica acquisita Coombs negativa
Ipoplasia midollare
Trombosi in sedi inusuali
Problemi gastrointestinali
• Dal 2005 in terapia con ciclosporina, siero
antilinfocitario,cortisone,copertura antibiotica e
antivirale,terapia trasfusionale xche’ Hb in media 10
g/dL
• Luglio 2008 episodio febbrile ,piastrinopenia e prime
urine scure
• Hb tra 7 e 9 g/dL (periodiche trasfusioni)
• Altri episodi di urine scure
• Comparsa di episodi di disfagia
• Astenia
• Ferritina elevata: 2500/3000
Segni e sintomi per la diagnosi
Nefrologo ed Urologo
• Emoglobinuria
• Insufficienza renale acuta in un grave episodio
di emolisi
Segni e sintomi per la diagnosi
Gastroenterologo
•
•
•
•
•
•
•
Dolori addominali
Disfagia
Sindrome di Budd-Chiari
Epatomegalia,algia epatica,ascite
Ischemia acuta transitoria,necrosi epatociti
Insufficienza epato-cellulare
Spasmi esofagei
Diagnosi
EPN emolitica
gli episodi di emoglobinuria,LDH elevato,assenze di
citopenie al di fuori dell’anemia,la reticolocitosi,la
percentuale cospicua di eritrociti GPI negativi
permettono di classificarla come
EPN francamente emolitica
possibile che EPN si sia sviluppata sul sottosfondo di
un’insufficienza midollare che
si è manifestata soltanto con una trombocitopenia
(confermata dal Prof.Luzzatto)
Linee guida nella diagnostica dell’EPN:
Immunofenotipo è un test di screening
•
•
•
•
•
•
Emoglobinuria
Anemia emolitica Coombs negativa
Citopenia di ndd
Anemia Aplastica
Sindromi mielodisplastiche (AR/basso rischio)
Trombosi (arteriose o venose)di
ndd,soprattutto in sedi inusuali
Linee guida nella diagnostica dell’EPN:
Immunofenotipo è un test elettivo
• Per il monitoraggio dell’EPN
• Per il monitoraggio dei cloni EPN
nell’Anemia Aplastica e nelle SMD
Iniziata terapia con eculizumab 2010,+
acido folico,sospese le altre terapie.
Vaccinazione antimeningococcica.
Terapia chelante per l’iperferritinemia
Riduzione delle trasfusioni,ma Hb sempre
tra 8 e 9,reticolocitosi, LDH 630
(aumentata la dose di eculizumab)
Sparita l ‘astenia
Miglior qualità vita
• Dal 2010 ai primi mesi 2011 Hb sempre
tra 8 e 9 ,raramente 10 g/dL;
• Frequenti episodi febbrili/terapia antibiotica
Ricovero in PN per broncopolmonite,terapia
con rocefin
• Livelli di Hb costanti 10g/dL,LDH
450,reticolociti 5%.
• riduzione trasfusioni
*Dal 2012 severa piastrinopenia, Hb sempre
tra 8 e 9 ,raramente 10 g/dL;
* aspirato midollare
* sospeso eculizumab
*Frequenti episodi febbrili/terapia antibiotica
*Vari ricoveri in PN per
broncopolmonite,terapia con rocefin
• Livelli di Hb tra 6.5 e 9 g/dL,
• LDH>1000,reticolociti 10%.
• Riprese trasfusioni ,+ frequenti
Agosto 2013 ricovero in Pn per dispnea
Hb 9 g/dL MCV 117
PLT 93 Neutrofili 1940
Exitus per emottisi acuta
Progetto educazionale
SCAPE
Standardization of a Cytometric Approach for
PNH clone Evaluation
Archivio www.clonePnh.com
Dati al 16 marzo 2010
Timeline.
Dall’inserimento dell’analisi al valore aggiunto
1. Inserimento dell’analisi nell’archivio
2. Conferma dei dati inseriti
3. Valutazione dell’analisi e dei marcatori
4. Andamento paziente
5. Revisione dell’analisi inserita
6. Validazione dell’analisi
7. Accesso alle statistiche
8. Remind
9. Newsletter ed eventi
Attori principali…
Test diagnostico standard per l'EPN
• Citofluorimetria eseguita sul sangue periferico
• Si dovrebbero valutare i granulociti e almeno una linea
cellulare supplementare
– Globuli rossi (RBC)
– Monociti
• Risultati quantitativi
– Analisi ottimale–elevata sensibilità: ≥0,01%
– Analisi di routine: ≥1%
• Referti EPN facili da capire
• Usare più di un reagente per le proteine ancorate al GPI
Borowitz MJ et al.; Clinical Cytometry Society. Cytom B Clin Cytom 2010;78B:211–230.
EPN
Sangue periferico
Aspirato Midollare
Protocollo EPN per i globuli rossi
Preparazione del campione :
• Diluire il campione di sangue periferico con PBS (1/500) per
ottenere una sospensione di globuli rossi.
• Prelevare 50 L della sospensione ed incubarli
accuratamente in provette da citometria, con appropriate
quantità di ogni anticorpo monoclonale.
• Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna
frazione di campione sia esclusa dalla reazione.
• Incubare per 20min. a 4 °C.
• Lavare con 2 mL di PBS a 2000 rpm per 3min in una
centrifuga da banco.
• Allontanare il sovranatante e risospendere in 200 L di PBS.
• Acquisire almeno 3.000 eventi (tecnica standard) o almeno
300.000 eventi (alta sensibilita’) .
Protocollo EPN per i leucociti
Preparazione del campione :
• Prelevare 50 L del sangue del paziente e incubarli accuratamente in provette da
citometria, con appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale.
• Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia esclusa
dalla reazione.
• Incubare per 20 min. a T.A. °C.
• Lisare con 2 mL di cloruro di ammonio. Agitare sul vortex e lasciare a temperatura
ambiente per 15 min.
• Centrifugare a 2000 rpm per 3 min. in una centrifuga da banco.
• Allontanare il sovranatante e risospendere in 200 L di PBS.
• Acquisire almeno 3.000 eventi (tecnica standard). Per l’alta sensibilita’ quadruplicare il
volume di partenza ed acquisire circa 300.000 eventi.
Per il Flaer eseguire la stessa procedura.
Metodica corretta
Metodica errata
PNH screening by flow cytometry
Main cell lineages
1. Red blood cells
2. Granulocytes and monocytes
Towards a consensus protocol?
Granulocyte
CD16
FLAER
Monocyte
CD33
FLAER
CD45
Erythrocyte
CD14
CD45
GPA
CD59
CD55
Naples approach: panel for cytometric analysis in
patients with suspected PNH
Suggested combinations:
Red cells
CD59 (PE)± CD55
Granulocytes
CD66b, CD33, CD45
Monocytes
CD14, CD33, CD45
GM
CD66b, CD33, CD45, CD14
Lymphocytes
CD48, CD33, CD45
CD3 or CD19 or CD56
Pannello EPN
FITC
PE
PeCy5
PE-Cy7
APC
APC-Cy7
Granulociti
FLAER
CD24
CD45
CD33
CD15
Monociti
FLAER
CD14
CD45
CD33
CD64
Globuli rossi
CD235a
CD59
CD45
FITC
PE
PeCy5
PE-Cy7
APC
APC-Cy7
Granulociti
Monociti
FLAER
CD24
CD64
CD14
CD15
CD45
Granulociti
Monociti
FLAER
CD157
CD64
CD33
CD15
CD45
Globuli rossi
CD235a
CD59
CD45
Classification of PNH cells
cell count
• PNH I
• PNH II
• PNH III
Normal cells
Partial deficiency
Complete deficiency
III
II
fluorescence intensity
I
CD14
PNH III
PNH II
PNH I
•PNH I
Normal cells
•PNH II
Partial deficiency
•PNH III
Complete deficiency
Test per diagnosticare l'EPN nei
globuli rossi
Paziente 1:
globuli rossi normali con
espressione di CD59
normale
(cellule di tipo I)
Paziente 2:
clone PNH con deficit
totale di CD59
(cellule di tipo III)
Gating su GPA+ globuli rossi
GPA = glicoforina A.
Fonte dei dati: Servizi diagnostici Dahl-Chase.
Paziente 3:
clone EPN con deficit
totale di
CD59
(cellule di tipo III) e
deficit parziale di CD59
(cellule di tipo II)
Controllo normale
Globuli rossi
Controllo normale
monociti
granulociti
The bacterial toxin Aerolysin
1.
2.
3.
4.
5.
Proaerolysin is a 52-kDa protein secreted by Aeromonas
hydrophila. After proteolytic nicking at the C-terminus,
the active form, Aerolysin binds to cell surface structures
and oligomerizes, forming channels that result in cell
lysis.
Aerolysin does not lyse PNH cells
It was used to enrich rare GPI-negative PNH clones.
An Alexa 488-linked version of a non-lysing, mutated
form of proaerolysin (FLAER) was generated with
specificity for GPI-linked structures but unable to cause
cell lysis.
FLAER cannot be used to assess PNH clones in the
erythrocyte lineage, since the latter do not possess
surface-bound proteolytic enzymes needed to process
the Proaerolysin.
D.R. Sutherland, 2007
monociti
granulociti
Comparison between FLAER and
CD66b
FLAER Alexa-488
“ Goccia esclusa”
PNH ?
PNH ?
PNH ?
“ Goccia esclusa”
Perché prendere in considerazione
non solo i globuli rossi nei test
diagnostici dell'EPN?
• I granulociti forniscono una rappresentazione più accurata
delle dimensioni del clone EPN1
• Le percentuali di globuli rossi EPN possono essere influenzate
da:
– Emolisi
– Trasfusione di sangue
I referti EPN dovrebbero fornire risultati quantitativi
che esprimano le dimensioni del clone sia nei granulociti sia nei globuli rossi
1. Borowitz MJ et al; Clinical Cytometry Society. Cytom B Clin Cytom 2010;78B:211–230.
Raccomandazioni dell'ICCS per test di
monitoraggio successivi di pazienti con
clone EPN individuato
• Monitoraggio annuale/bisemestrale
– Pazienti stabili
– Pazienti con anemia aplastica e clone EPN di piccole
dimensioni
– Pazienti con citopenia refrattaria con displasia unilineare
(RCUD) e clone EPN di piccole dimensioni
• Monitoraggio più frequente per valutare l'espansione dei
cloni
– Pazienti con sintomi o valori di laboratorio variabili
– Pazienti nelle fasi precoci della terapia
1. Borowitz MJ et al.; Clinical Cytometry Society. Cytom B Clin Cytom 2010;78B:211–230.
Which is the fate of PNH clone?
From L. Luzzatto, modified
C.GP
Globuli rossi
C.GP
monociti
granulociti
granulociti
Grazie per l’attenzione!!!