Transcript QUANT-BCR-ABL p210 1.002

Calcolo della Malattia Minima Residua(MRD)
Metodo del numero di copie normalizzato(NCN)
I risultati possono essere calcolati usando il numero di copie normalizzato (NCN). Questo
metodo prevede l’uso di curve standard testate in ogni seduta di PCR. In particolare,
QUANT-BCR-ABL p210 kit usa tre diluizioni standard di plasmidi per il gene di controllo
(ABL) e cinque diluizioni standard per il gene di fusione (BCR-ABL p210). Questo
metodo permette la compensazione della degradazione dei probes e la comparazione dei
dati prodotti da differenti strumenti Real –Time PCR .
Il numero di copie normalizzato (NCN) è definito come il numero di copie (CN) del gene
di fusione (FG) per una copia del trascritto del gene di controllo (CG):
Valore medio di log10(FGCN) - valore medio di log10(CGCN).
Nel metodo NCN, il valore della malattia minima residua (MRD) è il rapporto tra
l’espressione del FG normalizzata per CG nel follow-up (FGCN/CGCN)FUP ed i campioni
diagnostici (FGCN/CGCN)DX.
Per il calcolo del valore di MRD , i dati di Europe Against Cancer (EAC) (J. Gabert et al.
Leukemia 17, 2318-2357 -2003) possono essere usati per il corrispondente FG alla
diagnosi se il valore del paziente alla diagnosi non è disponibile.
La sensibilità (SENSv) è calcolata in accordo con la relative espressione del FG alla
diagnosi (FGCN/CGCN)DX e l’espressione CG (CGCN,FUP) nel follow-up del campione.
La formula EAC per il calcolo della MRD e la sensibilità teorica basata su FG e CG RealTime Quantitative –PCR
MRD value (MRDv) = (FGCN / CGCN)FUP / (FGCN/CGCN)DX
Sensitivity (SENSv) = CGCN,DX / (CGCN,FUP x FGCN,DX)
References
1) VHJ van der Velden et al. Leukemia 17, 1013-1034 (2003)
2) E. Beillard et al. Leukemia 17, 2474-2486 (2003)
3) J. Gabert et al. Leukemia 17, 2318-2357 (2003)
QUANT-BCR-ABL p210
Real-Time Quantitative PCR dei trascritti del gene di fusione M-bcr
1.002
Il cromosoma Philadelphia (Ph) è una delle più comuni aberrazioni genetiche riscontrate nelle leucemie.
Il Ph cromosoma è presente in più del 95% delle leucemie mieloidi croniche (CML). Inoltre, nelle leucemie
linfoblastiche acute (ALL) , Ph è presente nel 25-30 dei casi adulti e nel 2-5% dei casi infantili. Meno frequentemente, è associate con la leucemia mieloide acuta (AML).Il cromosoma Ph è il risultato della congiunzione della sequenza 3’ del proto-oncogene tyrosine –kinase c-ABL sul cromosoma 9 alla sequenza 5’ del
gene BCR sul cromosoma 22 . In particolare , il breakpoint sul cromosoma 9 è localizzato nella maggior parte
dei casi tra gli esoni 1 e 2 nel gene ABL.I breakpoints nel gene BCR sono raggruppati entro due regioni: 1) una
sequenza del primo introne, detta minor breakpoint cluster region (m-bcr); 2) una regione comprendente gli
esoni da 12 a 16 , detta major breakpoint cluster region (M-bcr).Nel caso di m-bcr , il primo esone del gene
BCR (e1) è affiancato al secondo esone del gene ABL (a2). Il risultante trascritto di fusione (e1-a2) codifica
una proteina chimerica di 190 KDa (p190) . Questo tipo di trascritto di fusione è presente nel 65% degli adulti
e nel 80% dei bambini ALL Ph positivi
Nel caso di M-bcr breakpoints gli esoni del gene BCR (b2 o b3) sono affiancati al secondo esone del gene ABL
(a2). Il risultante trascritto di fusione (b2-a2 e/o b3-a2) codifica una proteina chimerica di 210 KDa (p210).
Questo tipo di trascritto di fusione è presente nelle CML e circa nel 35% degli adulti ALL Ph positivi. Sono
stati osservati rari casi di trascritti e1-a3 ; b2-a3 e b3-a3 .
La quantificazione dei trascritti BCR-ABL è clinicamente rilevante per il monitoraggio della malattia minima
residua nei pazienti con leucemia sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali o trattamento con terapie
aggressive
Nel QUANT-BCR-ABL p210 kit la real time PCR è usata nel secondo step in un protocollo in due step
:reverse trasciption-polymerase chain reaction (RT-PCR). Il templato cDNA prodotto da una reazione di trascrizione inversa , è amplificato dalla PCR usando una coppia di primers specifici e un probe interno marcato
con due dyes (FAM-TAMRA). Durante la reazione , il taglio del probe , dovuto all’attività 5’ nucleasica della
Taq DNA Polimerase, separa il reporter dye (FAM) dal quencher dye (TAMRA) , dando luogo ad un aumento
di fluorescenza del reporter dye. L’accumulo di prodotti di amplificazione è rilevato direttamente monitorando
l’aumento di fluorescenza del reporter dye . Nel kit QUANT-BCR-ABL p210 , un controllo endogeno
(trascritto ABL) è amplificato nel campione così come il trascritto di fusione di interesse. Inoltre curve standard di quantità note sia del controllo endogeno ABL che del cDNA di fusione permettono il calcolo della ratio
tra il segnale dello specifico trascritto di fusione ed il segnale dell’endogeno ABL in ogni campione.
Il QUANT-BCR-ABL p210 permette la quantificazione dei trascritti BCR-ABL 210 nel sangue periferico o in campioni di midolo osseo di pazienti ALL o CML in accordo con Europe Against Cancer
studies (J. Gabert et al. Leukemia 2003).
REV. 01
Analisi dei risultati
Contenuto del kit e conservazione
nome
volume
Codice colore
conservazione
5X First -Strand Buffer
120ml
(verde)
-20°C
DTT 100 mM
60ml
(viola)
-20°C
RNase Inhibitor (40U/ml)
15ml
(marrone)
-20°C
Random hexamer 100mM
140ml
(bianco)
-20°C
dNTP 20 mM
30ml
(grigio)
-20°C
Reverse Transcriptase (200U/ml)
15ml
(giallo)
-20°C
H2O RNase/DNase-free
1ml
(azzurro
-20°C
St1-ABL-103 copies/5ml
25ml
(verde)
-20°C
St2-ABL-10 copies/5ml
25ml
(verde)
-20°C
St3-ABL-105 copies/5ml
25ml
(verde)
-20°C
St1-BCR-ABL p210 10 copies/5ml (b3-a2 M-bcr)
25ml
(rosso)
-20°C
St2-BCR-ABL p210 10 copies/5ml (b3-a2 M-bcr)
25ml
(rosso)
-20°C
St3-BCR-ABL p210 10 copies/5ml (b3-a2 M-bcr)
25ml
(rosso)
-20°C
St4-BCR-ABL p210 105 copies/5ml (b3-a2 M-bcr)
25ml
(rosso)
-20°C
St5-BCR-ABL p210 10 copies/5ml (b3-a2 M-bcr)
25ml
(rosso)
-20°C
130ml
(verde)
-20°C
REVERSE TRANSCRIPTION
Il numero di cicli dove l’intensità di emissione del reporter dye supera il background noise
è detto threshold cycle Ct ( ciclo soglia) . Il Ct è direttamente proporzionale al numero di
copie del templato target all’inizio della reazione ( su uno strumento TaqMan settare il Ct a
0.1 e la baseline tra i cicli 3 e 15) Usando curve standard di quantità note del controllo
endogeno ABL e del trascritto di fusione cDNA è possibile il calcolo del rapporto tra il
segnale del specifico tracritto di fusione e quello del controllo endogeno ABL ( lo slope
teorico della curva standard è -3,32 per una reazione PCR con massima efficienza)
Le figure sotto mostrano un esempio di Amplification plots e curve standard di ABl e
BCR-ABL p210 diluizioni standard.
STANDARD DILUTIONS
4
1
2
3
6
STANDARD DILUTIONS - Control gene ABL (St.1 - St.2 - St.3)
Amplification Plots
Standard Curve
REAL-TIME PCR
10X ABL (Primers/FAM-TAMRA probe)
10X BCR-ABL p210 (Primers/FAM-TAMRA probe)
150ml
(rosso)
-20°C
Master Mix 2X *
1,4 ml
(arancione)
+4°C
1ml
(azzurro)
-20°C
H2O RNase/DNase-free
*Master Mix include: i) passive reference dye ROX (6-carboxyl-X-Rodhamine) per normalizzare il reporter dye
fluorescente in real –time PCR, per gli strumenti che sono compatibili con questa opzione. ii) Uracyl-N-Glycosilase
(UNG) e dUTP system per prevenire il rischio di cross-contaminazione degli ampliconi.
Y = -3.507*LOG(X) + 38.95, Eff. = 92.8%
STANDARD DILUTIONS - Fusion gene BCR-ABL p210 (St.2 - St.3 - St.4 - St.5)
Amplification Plots
Standard Curve
Principio del metodo: A)estrazione RNA B) sintesi cDNA da RNA totale C) real-time PCR
Applicabilità: su RNA estratto e purificato da sangue periferico o cellule del midollo osseo.
Numero di test: 40
Stabilità: oltre 18 mesi se correttamente conservato.
.
Y = -3.378*LOG(X) + 40.15, Eff. = 97.7%