REAL-TIME QUANTITATIVE PCR DEI TRASCRITTI DEL GENE DI FUSIONE bcr3 QUANT-PML-RARA bcr3 Cat. n.1.005

La traslocazione t(15;17)(q22;q21) è associata con la leucemia promielocitica acuta (APL), una distinta leucemia mieloide acuta (AML) con citomorfologia M3, che rappresenta circa il 10-15% delle AML. I due geni coinvolti nella t(15;17) sono PML, codificante per un fattore di trascrizione, sul cromosoma 15 ed il gene del recettore α dell’acido retinoico (RARA) sul cromosoma 17. La proteina chimerica PML-RARA prodotta da questa traslocazione è un repressore trascrizionale. I breakpoints del cromosoma 17 sono localizzati entro un frammento di DNA di 15 kb nell’introne 2 di RARA. In contrasto, tre regioni del locus PML sono coinvolte nei breakpoints: introne 6 (bcr1; 55% dei casi), esone 6 (bcr2; 5%) e introne 3 (bcr3; 40%). Di conseguenza, ci sono tre possibili isoforme PML-RARA, tipo bcr1 o L (long), tipo bcr2 o V (variant) e tipo bcr3 o S (small). Nell’ultimo decennio, all-trans-retinoic acid (ATRA) è usato per il trattamento della maggior parte dei pazienti APL. ATRA è un agente non tossico che attiva il recettore dell’acido retinico (RAR), inibisce la proliferazione e promuove la differenziazione dei promielociti leucemici. La quantificazione dei trascritti PML-RARA è rilevante per il monitoraggio e l’adattamento del trattamento. C’è un generale consenso sul fatto che una PCR positiva per PML-RARA dopo la terapia sia un forte elemento predittivo di una seguente ricaduta ematologica, mentre ripetuti risultati negativi sono associati ad una sopravvivenza a lungo termine. Il monitoraggio dei livelli di trascritti di fusione può essere utile per prevenire ricadute mentre il paziente è ancora in remissione ematologia e citogenetica.. Il kit QUANT-PML-RARA bcr3 permette la quantificazione dei trascritti bcr3 mediante l’uso della real-time PCR. In particolare, il cDNA, prodotto da una reazione di trascrizione inversa, è amplificato con una coppia di primers specifici e un probe interno FAM-TAMRA. Il kit contiene: un controllo endogeno (trascritto ABL) che è amplificato nel campione così come il trascritto di fusione bcr3 e curve standard di quantità note sia del controllo endogeno ABL che del cDNA di fusione che permettono il calcolo della ratio tra il segnale del trascritto di fusione ed il segnale endogeno di ABL in ogni campione. Il kit QUANT-PML-RARA bcr3 permette la quantificazione dei trascritti PML-RARA bcr3 nel sangue periferico o in

campioni di midollo osseo di pazienti AML in accordo con Europe Against Cancer studies (J. Gabert et al. Leukemia 2003). Principio del metodo: Applicabilità: Numero di Test:

forniti in eccesso). a) estrazione RNA; b) sintesi cDNA da RNA totale; c) real-time PCR. su RNA estratto e purificato da sangue periferico o cellule del midollo osseo. 16 campioni in duplicato o 104 reazioni in 2 distinti esperimenti (considerando errori di pipettaggio, i volumi sono

CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE

RETROTRASCRIZIONE 5X First-Strand Buffer DTT 100 mM RNase Inhibitor (40U/ Random hexamer 100mM dNTP 20 mM H H 2 REAL-TIME PCR Master Mix 2X 2

Stabilità: Materiali Richiesti:

µ O DNase/RNase-free l) Reverse Transcriptase (200U/ STANDARD DILUTIONS St1-ABL-10 3 copies/5 µ l St2-ABL-10 4 copies/5 µ l St3-ABL-10 5 copies/5 µ l µ l) St1-PML-RARA bcr3 10 1 copies/5 µ l St2-PML-RARA bcr3 10 2 copies/5 µ l St3-PML-RARA bcr3 10 3 copies/5 µ l St4-PML-RARA bcr3 10 5 copies/5 µ l St5-PML-RARA bcr3 10 6 copies/5 µ l 10X ABL (Primers/FAM-TAMRA probe) 10X PML-RARA bcr3 (Primers/FAM-TAMRA probe) O DNase/RNase-free superiore a 18 mesi se correttamente conservato. Provette da PCR con tappo ottico.

Reagenti richiesti non compresi nel kit:

-20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C +4°C -20°C provette da 1,5 ml e da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; Per l'estrazione dell’RNA si consiglia di utilizzare il seguente kit: • Kit Estrazione RNA - cat. n. 102

Strumenti richiesti:

centrifuga con rotore ad angolo fisso per provette da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml (1.500 x g); Set di pipette pre-PCR e post-PCR (0.5 – 20 µ l, 10 – 100 µ l, 20 – 200 sterili, DNase/RNase free e monouso. µ l, 200 – 1000 µ l); Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Strumento Real-time PCR. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Il kit contiene tre diluizioni standard di plasmidi per il gene di controllo (ABL) e cinque diluizioni standard per il gene di fusione (PML-RARA bcr3). Usando queste curve standard è possibile il calcolo del rapporto (ratio) tra il segnale del trascritto di fusione e quello del controllo endogeno ABL in ogni campione. Le figure sotto mostrano un esempio di Amplification plots e curve standard di ABL e PML-RARA bcr3 (diluizioni standard). (FG STANDARD DILUTIONS - gene di controllo ABL (St.1 - St.2 - St.3) STANDARD DILUTIONS - gene di fusion e PM L-RARA bcr3 (St.2 - St.3 - St.4 - St.5)

Calcolo della Malattia Minima Residua (MRD)

I risultati possono essere calcolati usando il numero di copie normalizzato (NCN). Il numero di copie normalizzato (NCN) è definito come il numero di copie (CN) del gene di fusione (FG) per una copia del trascritto del gene di controllo (CG). Nel metodo NCN, il valore della malattia minima residua (MRD) è il rapporto tra l’espressione del FG normalizzata per CG nel follow-up CN /CG CN ) Amplification Plot s Amplification Plots FUP St andard Curve Y = -3.202*LOG(X) + 38.102 Standard Curve Y = -3.343*LOG(X) + 37.603 ed i campioni alla diagnosi (FG CN /CG CN ) DX .

BIBLIOGRAFIA

VHJ van der Velden et al. Leukemia 17, 1013-1034 (2003) E. Beillard et al. Leukemia 17, 2474-2486 (2003) J. Gabert et al. Leukemia 17, 2318-2357 (2003)