Mappatura fisica

Prof. Mario Ventura

Capitoli 8 + 14 + Appunti

Tipi di mappe: mappe fisiche e genetiche

  

Mappe fisiche: localizza i geni (o marcatori) lungo i cromosomi usando misurazioni che sono il riflesso di distanza fisica. Si distingue a bassa ed alta risoluzione

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Mappe genetiche: si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori (analisi di linkage). Possono essere di varia natura: fenotipo dell

’

individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.

  

Sono la connessione fra una realta

’

biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo

’

procedere

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Mappatura fisica

La mappatura fisica comprende una varieta ’ di modi diversi, ciascuno dei quali usa diverse unita ’ di misura e fornisce diversi livelli di risoluzione, che vanno dall ’ intero cromosoma alla singola coppia di basi. Esistono diversi tipi:   mappatura per trasferimento di cromosomi   mappatura mediante ibridazione in situ Mappatura significa localizzare una sequenza di DNA sui cromosomi Prof. Mario Ventura

Sistemi di isolamento del DNA cromosomico

miscela di cromosomi trattati con fluorocromo Spesso puo ’ essere importante isolare uno o piu ’ cromosomi dal resto e per questo possono essere utilizzati due approcci: - Flow Sorting - Costruzione di ibridi somatici selezioni la lunghezza d ’ onda di interesse (selezionante) Prof. Mario Ventura

Come usare i cromosomi sortati per fare la mappatura?   Avendo i cromosomi tutti isolati in provette e’ possibile usare tutti gli approcci gia’ noti per trovare la localizzazione di una regione specifica.   PCR con primer disegnati sulla sequenza da studiare slot blot o dot blot con probe (come lo crei?) sul DNA genomico di ogni provetta fissato su filtro di nitrocellulosa Prof. Mario Ventura 5

Un altro di stema di mappatura usa gli ibridi cellulari: cosa sono? come si fanno? Gli ibridi sono cellule che contengono patrimoni genetici diversi tra loro. Nel caso specifico HSA e topo. Le cellule vengono fuse e il sistema ritiene tutti i cromosomi di topo e qualche o un cromosoma umano. Si distinguono in:

Ibridi cromosomici (Usati anche come WCP)

se ritengono piu ’ cromosomi umani o parti di essi a causa di fenomeni di rottura che si realizzano casualmente 1.

Ibridi monocromosici (Usati anche come WCP)

se ritengono un solo cromosoma umano. Si possono ottenere: da ibridi (a seguito di eliminazioni successive del vari cromosomi di uomo) 2.

da preparati FACS messi in formazione di ibrido

Ibridi cromosomici da radiazione (Usati anche come PCP)

  se ritengono frammenti di uno o piu ’ cromosomi. Si ottengono per irradiazione degli ibrdi precedenti e successiva ulteriore fusione Prof. Mario Ventura 6

Sistema di selezione per ibridi cellulari

H ypoxantyne A minotperin T ymidine TK - HPRT + PEG HPRT - TK + HAT Nel sistema HAT solo le cellule TK+ e HPRT+ sopravvivono In humans: HPRT on chr. Xq26; TK on chr. 17q25 altri sistemi di selezione: - ouabaina; - alanosina-adenina Prof. Mario Ventura 7

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IBRIDI DA RADIAZIONE

Prima di utilizzare gli ibridi per fare la mappatura e’ NECESSARIO e FONDAMENTALE procedere con la caratterizzazione degli ibridi: Capire cioe’ quali sono i cromosomi che casualmente sono stati trattenuti dal processo di formazione dell’ibrido stesso.

Caratterizzazione di ibridi

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Caratterizzazione di ibridi: grossolana

Il DNA dell’ibrido viene estratto e sottoposto ad ALU-PCR. Questo passaggio e’ fondamentale per aumentare la rappresentativita’ del DNA umano vs il DNA murino (non ci sono sequenze ALU). La ALU-PCR utilizza primer disegnati sulle sequenze Alu ma con orientamento esterno alle sequenze stesse, per avere una amplificazione di sequenze inter Alu. Successivamente eseguo una FISH SU

METAFASI UMANE

dei prodotti di ALU-PCR Prof. Mario Ventura

WCP cromosoma 17

Prodotti Alu-PCR di un ibrido monocromosomico ibridati su metafasi umane normali Prof. Mario Ventura

Caratterizzazione dell

’

ibrido HY #240

mediante FISH l caratterizzaione fisica mediante STS ( Prof. Mario Ventura ’ indicazione e ’ grossolona, motivo per cui si procede con una

importante per la caratterizzazione degli ibridi da radiazione!!!

).

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IBRIDI DA RADIAZIONE

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Pannello ibridi da radiazione chr4

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Painting cromosomica parziale (2p)

Ogni STS e ’ mappato e localizzato precisamente nel genoma umano. Scegliendo opportunamente vari STS (ausilio di programmi bioinformatici e database) e ’ possibile testare per contenuto di STS le varie linee ibride ottenute Caratterizzazione mediante STS di un pannello del cromosoma 5 RH STS Prof. Mario Ventura

Uso degli ibridi in mappatura fisica

lane 4:Human control lane 3:CHO control lane 2:Positive hybrid lane 1:Negative hybrid

Southern di genomico di ibridi

Ovviamente posso usare anche la PCR per avere la stessa risposta!!! Prof. Mario Ventura

Mappatura del gene AQP8

Human CHO Positive hybrids Negative hybrids IBRIDI Prof. Mario Ventura

Mappatura del gene AQP8

Il gene e’ localizzato su quel cromosoma che e’ sempre presente sugli ibridi risultati positivi e sempre assente sugli ibridi risultati negativi. Nell’esempio iol gene e’ localizzato nel cromosoma 16 Prof. Mario Ventura

cromosoma sul vetrino

A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T

denaturazione

A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T

Prof. Mario Ventura FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo denaturazione

A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T

doppia elica di DNA

A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T A

ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino

T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T

osservazione del vetrino 20

FISH

Per la FISH si possono utilizzare: 1.

  Sonde puntiformi (fosmidi, cosmidi, BAC, PAC o YAC) 1.

2.

Sonde ottenute da ibridi (librerie totali e parziali) che colorano interamente o parzialmente i cromosomi

2. Prof. Mario Ventura

FISH: mappatura fisica ad alta e bassa risoluzione la risoluzione (la distanza minore per cui due sonde ibridate contemporaneamente possono essere visualizzate comeentita ’ separate) di tale tecnica dipende dal materiale target (sempre cromosomi) che si utilizzano: cromosomi metafasici (FISH classica) allungati con citocentrifuga (Stretched FISH) nuclei interfasici (FISH in interfase) fibre di cromatina (Fiber FISH) 1.5 - 2.0 Mb Prof. Mario Ventura 50 - 500 kb 800 kb - 1.5 Mb <5 - 700 kb 22

Prof. Mario Ventura Costruzione di Contigui di cloni

Costruzione di contigui: restriction vs STS mapping

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Costruzione di contigui

Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico

1.

Costruzione di un STS per il locus genomico  Costruzione di una sonda specifica

2.

Utilizzo sonda per screening su libreria di BAC  Cloni positivi

3.

BAC End sequencing  BAC ENds mapping (contro un genoma di riferimento)

4.

Costruzione STS dalle ends piu’ lontane dal punto di partenza  Costruzione di una sonda specifica Prof. Mario Ventura

Costruzione di contigui: BAC Ends mapping

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Costruzione di contigui: BAC Ends mapping

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Costruzione di contigui: BAC Ends mapping

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Sequenziamento del genoma umano: Analisi della struttura dei genomi e progetti genomici

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