Prof. Mario Ventura

Identificazione dei geni che causano malattia nell

’

uomo

(importante sapere BENE mappatura fisica e genetica) Capitolo 16

1

Cosa e

’

una malattia?

Cosa e ’ una variante?

Cosa e

’

il daltonismo, malattia o variante?

Una variazione da ’ sempre una variante?

Come si cerca una variante?

Attenti alla letalita ’ embrionale e alla ridondanza genetica (altri geni con la medesima funzione) Scopo: scoprire quali variazioni della sequenza di DNA sono responsabili di un fenotipo patologico Prof. Mario Ventura SINO AL 1980 POCHI SVILUPPI ... DOPO ... 2

Prof. Mario Ventura

Strategie

I principi utilizzati possono essere essenzialmente di due tipi:   quelli che nn richiedono di conoscere la localizzzione cromosomica del locus della malattia   quelli dipendenti dalla localizzazione del locus malattia    IDENTIFICAZIONE CON STRATEGIE FUNZIONALI (indipendente dalla posizione): le basi biochimiche della patogenesi sono note. Utile in pochi casi (molto diffuso in passato)    IDENTIFICAZIONE CON STRATEGIE POSIZIONALI: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. Diversi approcci paralleli devono essere seguiti per identificare un gene “ patologico ”’ E ’ impensabile pensare di seguirne solamente uno, spesso sono piu ’ d ’ uno i geni candidati. Prof. Mario Ventura 4

  

Attenzione!

Le strategie sono alternative, la scelta dipende dalle informazioni di partenza, ma ovviamente nel corso dello studio si integrano: praticamente alla fine si usano tutte. Non esiste quella giusta in assoluto esiste quella che mi puo ’ dare maggiori risultati nelle condizioni sperimentali in cui mi trovo ad operare. Prof. Mario Ventura 5

Strategia funzionale (indipendenti dalla posizione)

   CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della patogenesi sono note.

Conoscendo il prodotto proteico…

   Definizione della sequenza amminoacidica    Identificazione delle regioni con degenerazione minima: arg e trp codificati da AUG e UGG    Sintesi di oligonucleotidi parzialmente degenerati    Screening di una library di cDNA    Screening di una library di DNA genomico   

EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII

Prof. Mario Ventura 6

Prof. Mario Ventura

Strategia funzionale della fenilchetonuria Conoscendo il prodotto proteico…

   Produzione di anticorpi specifici coniugando con apteni forti    Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione    Screening della library di espressione e isolamento della colonia    Allargamento della colonia    Screening di una library di DNA genomico   

FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilasi

Vettore di espressione cDNA Piastramento su terreno di crescita in cui il vettore e ’ indotto ad aprimere la proteina S t a m p a s u membrana Lavaggi Autoradiogra f i a p e r evidenziare i cloni positivi Ibridazione con anticorpo marcato che interagisce solo con le proteine prodotte per cui c ’ e ’ una specifica interazione 7

Identificazione di un gene patologico conoscendone la sua funzione normale

Si parte da un saggio di complementazione funzionale, in cui si cercano frammenti di DNA isolati a caso che modifichino una funzione in un organismo ricevente o in una linea cellulare difettiva. Prof. Mario Ventura

Complementazione nel topo transgenico Isolamento di oncogeni attivati

8

Complementazione nel topo transgenico

il gene DFNB3 identificato grazie al gene di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche ’ gira su se stesso e scuote la testa. Prof. Mario Ventura 9

Isolamento di oncogeni attivati

Cellule di topo vengono trasfettate con DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata vuol dire che contengono un oncogene

libreria fagica Trasfezione di frammenti di DNA umano da tumore Selezione di una colonia trasformata ricerca sequenze

Alu

Alcune cellule sono trasformate Coltura di cellule NIH-3T3 di topo fagi che potrebbero contenere l

’

oncogene

Prof. Mario Ventura 10