Transcript La fissazione dei tessuti - Morfologia umana e biologia applicata

LA FISSAZIONE DEI TESSUTI
NATURA E SCOPO DELLA FISSAZIONE
•Consiste nella stabilizzazione fisica
e chimica dei costituenti cellulari e
tissutali
•Determina nel tessuto il
cambiamento verso uno stato il più
vicino possibile a quello della
materia vivente, ma tale da
consentire l’allestimento di preparati
microscopici
•La fissazione rende insolubili i
costituenti chimici della sostanza
vivente
LE STRUTTURE BIOLOGICHE OGGETTO DI
STUDIO DEVONO ESSERE PRESERVATE DA
•
•
•
alterazioni postmortali determinate
dagli enzimi autolitici presenti in ogni
cellula
enzimi ed agenti litici speciali di
singoli organi (ad esempio, l’acido
cloridrico e gli enzimi idrolitici del
succo gastrico)
enzimi litici esogeni, prodotti da
batteri
LA FISSAZIONE DELLE PROTEINE
 le
principali responsabili delle
caratteristiche morfologiche e funzionali
della sostanza vivente sono le proteine
 la fissazione comporta la denaturazione
delle proteine ed è ottenuta proprio grazie
alla loro denaturazione
 la fissazione delle proteine comporta, in
grado più o meno elevato, la fissazione di
altri tipi di molecole:


legate chimicamente alle proteine che vengono
fissate
trattenute all’interno delle maglie del gel proteico
determinato dalla fissazione medesima
DENATURAZIONE DELLE PROTEINE



Consiste nella trasformazione della disposizione spaziale
della catena polipeptidica (o delle catene, se più di una)
dalla disposizione tipica della proteina nativa (quella
presente in vivo) verso una più disordinata
Ne consegue la modificazione delle proprietà chimiche,
fisiche e biologiche della proteina e in particolare una
diminuzione della solubilità
le proteine denaturate possono:



flocculare (una flocculazione, o gelificazione, irreversibile si
definisce coagulazione)
formare un gel dello stesso volume della soluzione originaria
la fissazione di cellule e tessuti deve comunque avvenire
con la minima alterazione possibile della struttura delle
proteine, sia primaria sia di ordine superiore
METODI DI FISSAZIONE
i
metodi disponibili per la
fissazione sono di due tipi:
chimici
fisici

REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI
I requisiti per effettuare una buona fissazione sono
1)Precocità
Il tessuto va fissato il prima possibile dopo il prelievo
dall’organismo
 se si tratta di materiale autoptico, il prima possibile dopo il
decesso dell’individuo
 il requisito della precocità è particolarmente significativo
per studi di microscopia elettronica
 la resistenza di un tessuto alle alterazioni post-mortali
varia da tessuto a tessuto


è anche in funzione di:


stato funzionale
eventuale patologia
REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI

2) Piccole dimensioni del frammento da fissare
gli agenti fissativi penetrano nel tessuto dalla superficie
verso l’interno
 I frammenti grossi si fissano male nel loro interno


3) Idoneo mezzo di fissazione
a seconda del tipo di studi che si intendono eseguire
 spesso è necessario l’impiego di metodi fissativi differenti
su frammenti dello stesso materiale biologico


4) abbondanza del mezzo fissativo

nel caso di agenti fissativi chimici in soluzione
ARTEFATTI
 in
tutti i casi, si deve tener conto dei possibili
artefatti determinati durante la fissazione
 sono tutte quelle modificazioni dei caratteri
morfologici ed istochimici, rispetto allo stato
vivente, che insorgono durante la preparazione
del tessuto per l’osservazione microscopica
 devono essere minimi
 non sono mai eliminabili completamente e se ne
deve tenere conto nell’interpretazione dei
risultati
ARTEFATTI DA FISSAZIONE
I principali
artefatti che possono insorgere durante la
fissazione sono i seguenti:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
coartazione dei tessuti, con possibili distacchi tra
tessuti di diversa consistenza e con diverso contenuto
in acqua
rigonfiamento di tutto il tessuto o di alcune sue parti
indurimento del tessuto
estrazione di sostanze solubili negli agenti fissativi
spostamento di sostanze all’interno del preparato
(esempio tipico le cosiddette immagini di fuga del
glicogeno, apprezzabili nei preparati fissati con
etanolo)
blocco di gruppi chimici, per reazione con gli agenti
fissativi
introduzione di gruppi chimici estranei al tessuto e
presenti negli agenti fissativi
smascheramento di gruppi chimici del tessuto che
sono impegnati in legami chimici da cui vengono
liberati ad opera degli agenti fissativi
ARTEFATTI DA FISSAZIONE



gli artefatti si producono nell’intervallo di tempo che
intercorre tra l’arrivo dell’agente fissativo in una
porzione del preparato e la sua completa fissazione
in questo intervallo si hanno alterazioni delle
proprietà delle cellule e dei tessuti prima che si
completi la insolubilizzazione delle proteine tissutali
Le alterazioni delle cellule consistono in



perdita della impermeabilità selettiva delle membrane
cellulari
inattivazione di enzimi indispensabili alla vita cellulare,
ecc.
una volta che l’insolubilizzazione è completa, gli
artefatti compaiono solo in piccola misura e in casi
limitati
CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI CHIMICI
I


fissativi chimici si possono suddividere in:
1) fissativi primari
2) fissativi secondari
1) fissativi primari

sono quelli che assicurano da soli una efficace conservazione delle
cellule e dei tessuti, rispettandone l’architettura generale e la
struttura, in quanto agiscono sulle proteine tissutali
2) fissativi secondari o accessori




da soli non sono in grado di fissare il tessuto nel suo complesso per la
scarsa o nulla azione sulle proteine,
utili, talora indispensabili, per fissare altre componenti
macromolecolari della sostanza vivente, che non sono conservate
efficacemente dai fissativi primari
si devono usare insieme a quelli primari, mai da soli
esempi


per microscopia ottica: il cloruro ed il bromuro di etilpiridinio
per microscopia elettronica, oltre ai precedenti il blu alcian 8GX o il rosso
rutenio (non impiegati per il microscopio ottico perché sono dotati di colore
proprio e quindi interferiscono con successive reazioni di colorazione)
FISSATIVI PRIMARI

I fissativi primari si suddividono in


coagulanti (precipitazione grossolana di ovoalbumina)
non coagulanti (fine precipitazione)

La distinzione dipende dall’effetto che i fissativi producono su
soluzioni di ovalbumina
Questa classificazione è del tutto empirica e non si riferisce all’effetto dei
fissativi sui tessuti (la fissazione di un tessuto biologico comporta sempre un
grado variabile di coagulazione, cioè una insolubilizzazione irreversibile
delle proteine tissutali)

I fissativi primari coagulanti sono:



etanolo, metanolo, acetone, cloroformio, bicloruro di mercurio,
acido picrico, triossido di cromo, acido cromico, acido
tricloroacetico
I fissativi primari non coagulanti sono:

formaldeide, glutaraldeide, acroleina, tetrossido di osmio
(impropriamente chiamato anche acido osmico), bicromato di
potassio, permanganato di potassio, dietilpirocarbonato,
parabenzochinone, acido acetico
MECCANISMI DI AZIONE DEI
FISSATIVI CHIMICI PRIMARI
i principali effetti dei fissativi chimici primari sulla sostanza
vivente:
1) modificazione delle caratteristiche del solvente


alcoli, acetone e cloroformio, si sostituiscono all’acqua
acidi, modificano il pH di soluzioni acquose
2) reazioni chimiche con le proteine (possibile formazione di
legami chimici senza formazione di ponti intermolecolari)

esempio: tetrossido di osmio che è un forte ossidante
3) reazioni chimiche con le proteine (con formazione di ponti
intermolecolari)



Esempio: aldeidi che sono capaci di reagire contemporaneamente con
gruppi reattivi di due diverse catene peptidiche
singoli agenti fissativi possono agire attraverso più meccanismi
la migliore conservazione dell’architettura generale e della fine
struttura dei tessuti e delle cellule è fornita da agenti che
formano ponti intermolecolari
FISSATIVI CHIMICI PRIMARI
ETANOLO, METANOLO ACETONE CLOROFORMIO





agiscono sostituendosi al solvente fisiologico, l’acqua;
denaturano la maggior parte delle proteine, con
esclusione delle nucleoproteine
si impiegano per ricerche immunoistochimiche
nonostante la loro azione drastica sulle proteine,
si usano di solito per tempi brevi e a freddo (4°C)
Alcoli, acetone e cloroformio sciolgono la maggior parte
dei lipidi;
provocano notevole indurimento e coartazione dei
tessuti
BICLORURO DI MERCURIO
il bicloruro di mercurio (sublimato corrosivo: HgCl2)
 agisce stabilendo legami con le proteine;


lo lone HgCl+ reagisce con gruppi sulfidrilici (tioli: —SH),
carbossilici (—COOH), idrossilici (—OH) delle proteine e
con i gruppi fosfato degli acidi nucleici
il bicloruro di mercurio è un discreto ossidante;
 provoca coartazione e indurimento dei tessuti di grado
molto modesto
 il bicloruro di mercurio forma spesso dei precipitati
aghiformi nei tessuti che vengono rimossi mediante
trattamento con soluzione di iodio e ioduro di potassio

ACIDO PICRICO



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


L’acido picrico (trinitrofenolo) presenta in superficie numerosi
atomi di ossigeno elettronegativi
altera le cariche superficiali delle proteine con conseguente
formazione di aggregati gelificati delle proteine alterate
l’acido picrico può anche formare ponti intermolecolari tra
proteine fibrose
l’acido picrico non ha effetti diretti sui lipidi, che non sono né
estratti, nè insolubilizzati nei confronti dei successivi trattamenti
con solventi dei lipidi
conserva il glicogeno grazie alla sua azione sulle proteine con le
quali il glicogeno può essere associato (formano un reticolo
tridimensionale all’atto della fissazione)
è scarsamente penetrante e provoca fortissima coartazione dei
tessuti, ma non indurimento
si usa in soluzione satura acquosa (circa 1,4%) o alcolica
cristallizzato idrato può essere conservato senza precauzioni
particolari (è in tal caso di colore giallo)
cristallizzato anidro (di colore bianco) è esplosivo
FORMALDEIDE
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
la formaldeide (HCHO) è il fissativo più frequentemente impiegato nelle
ricerche istochimiche, da solo o in associazione ad altri
è in grado di legarsi con legami covalenti con numerosi gruppi chimici
contenenti un atomo di idrogeno reattivo:
R-H + HCHO  R-CH2OH
la formaldeide è usata alla concentrazione di circa il 4%, a pH tra 7,3 e
7,4, a temperatura ambiente o a 4°C, alla pressione atmosferica
in queste condizioni, la formaldeide reagisce soprattutto con anelli
aromatici e con gruppi aminici (—NH2 )
una volta legatasi ad una proteina, la formaldeide può reagire con un
idrogeno reattivo di una seconda molecola formando ponti intermolecolari
la formaldeide reagisce con le strutture biologiche in modo relativamente
lento; è discretamente penetrante
la formaldeide conserva la maggior parte dei lipidi (li rende insolubili nei
confronti dei solventi)
conserva solo parzialmente il glicogeno
determina indurimento dei tessuti



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
la formaldeide si trova in commercio come formolo o formalina:
 soluzione di formaldeide (un gas in condizioni normali) in
acqua, alla concentrazione di circa 36—40% (peso/volume),
stabilizzata con circa il 10% di metanolo
la formalina del commercio è usata in concentrazione del 10%
(corrispondente a circa il 4% di formaldeide in soluzione),
per lo più viene usata in soluzione tamponata oppure con
l’aggiunta di cloruro di calcio, per ottenere una migliore
stabilizzazione dei lipidi
un lungo soggiorno dei frammenti di tessuto in formalina è
possibile, ma mai consigliabile perché provoca indurimento;
la formaldeide può essere inoltre ottenuta, pura, da un suo
polimero, la paraformaldeide (polvere bianca)
per preparare una soluzione di formaldeide si scioglie la
paraformaldeide in acqua alla concentrazione desiderata,
scaldando l’acqua a 60°C ed aggiungendo alcune gocce di soda
(Na0H, 1N)
la formaldeide ottenuta dalla paraformaldeide si usa anche per
studi di microscopia elettronica, la formalina no, a causa della
presenza del metanolo nella soluzione
GLUTARALDEIDE


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

La glutaraldeide (CHO—(CH2)3-CHO ha meccanismo di azione
simile alla formaldeide ed è un reagente bifunzionale
A differenza della formaldeide, l’aldeide glutarica introduce
gruppi aldeidici liberi nei tessuti
La glutaraldeide è molto meno penetrante della formaldeide, ma
garantisce la fissazione dei fosfolipidi e degli sfingolipidi e,
almeno parzialmente, di tutti gli altri lipidi
E’ usata per microscopia elettronica, a concentrazioni comprese
tra il 2% e il 6%;
in commercio si trova in soluzione acquosa, in confezioni
ermetiche in atmosfera di azoto per evitare processi di
ossidazione e conseguente polimerizzazione ad opera
dell’ossigeno atmosferico; va conservata al buio
La glutaraldeide è dotata di fluorescenza primaria
TETROSSIDO DI OSMIO


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
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

Il tetrossido di osmio (OsO4) è in grado di reagire con numerosi
gruppi chimici, comportandosi da energico ossidante;
reagisce con gruppi alcolici ( =CHOH) con eteri (R—0—R’), con
gruppi aldeidici (—CHO) e chetonici (=CO) ma solo se questi gruppi
sono presenti in molecole a lunga catena carboniosa, con gruppi
sulfidrilici (—SH) e disolfuro (—S—S—) con gruppi aminici (—
NH2) determinando una deaminazione ossidativa, con gruppi
guanidinici, imidazolici e pirrolici, con i doppi legami dei lipidi
reagiscemolto lentamente anche con idrocarburi saturi
Il tetrossido d’osmio è poco penetrante, per cui frammenti di tessuto
non devono superare 1 mm di spessore;
provoca una modica coartazione ed un notevole indurimento dei
tessuti
Il tetrossido d’osmio reagisce anche con i lipidi,
si scioglie in essi e può così reagire con i loro gruppi reattivi,
venendo ridotto a biossido di osmio (OsO2 nero)
Il biossido di osmio si comporta come un colloide carico
negativamente che è attratto da forze elettrostatiche verso il polo
idrofilo dei fosfolipidi; questo fenomeno può spiegare, almeno in
parte, la distribuzione dell’osmio nelle membrane cellulari
ACIDO ACETICO
 L’acido
acetico (CH3-COOH) determina una
acidificazione del solvente fisiologico ed
esercita così la sua azione fissativa
 E’ usato in miscele fissative per microscopia
ottica
 Dopo fissazione in miscele contenenti acido
acetico si devono passare i tessuti
direttamente in alcool a 80° per evitare un
rigonfiamento eccessivo dei tessuti in generale
e delle fibre collagene in particolare
ESECUZIONE DELLA FISSAZIONE CON AGENTI CHIMICI
La fissazione con agenti chimici può essere effettuata
mediante esposizione a vapori del fissativo (soprattutto
formaldeide) nel caso di sottili sezioni di tessuto o
cellule isolate
 Più comunemente, la fissazione con agenti chimici si
esegue mediante soluzioni fissative:
 possono contenere un solo agente fissativo sciolto in
acqua o in soluzioni saline oppure più fissativi
miscelati tra loro o sciolti in acqua o in soluzioni
saline
 per queste miscele oltre agli agenti fissativi sono
impiegati sali minerali e talora saccarosio, per
regolare la solubilità dei fissativi, il pH, la pressione
osmotica e la forza ionica
 Le soluzioni fissative possono essere impiegate:



Per immersione dei frammenti da fissare (fissazione per immersione),
perfondendo l’albero circolatorio di un organo o di un intero, piccolo
animale (fissazione per perfusione)
LE MISCELE FISSATIVE
Le miscele fissative devono tener conto della
compatibilità reciproca tra i fissativi impiegati:
 alcuni fissativi possono essere mescolati tra loro
solo al momento dell’uso, perchè col tempo
reagiscono l’uno con l’altro, inattivandosi
 Le miscele fissative si propongono di compensare i
difetti dei singoli agenti impiegati e di ottenere una
fissazione completa ed adeguata sotto il profilo
morfologico e chimico

MISCELE FISSATIVE
Liquido di Bouin.
•E’ uno dei fissativi più usati per le preparazioni
istologiche di routine.
•Essendo molto penetrante serve per fissare pezzi di
organi anche voluminosi e permette l’uso di quasi tutti i
metodi di colorazione.
•Si presta per allestire tanto preparati di insieme quanto
citologici.
Soluz. satura acquosa di acido picrico
Formalina
Acido acetico glaciale
ml
ml
ml
15
5
1
Si mescolano le parti al momento dell’uso.
Durata della fissazione: secondo la grossezza dei pezzi
da 12 a 48 ore.