Transcript 22-Struttura e replicazione del DNA

ACIDI NUCLEICI..................................................................................................2
FUNZIONI DEL DNA.............................................................................................5
FUNZIONI DELL’RNA...........................................................................................5
I NUCLEOTIDI.....................................................................................................6
Struttura dei nucleotidi..........................................................................6
Modello di Watson e Crick....................................................................10
Organizzazione strutturale superiore del DNA........................................13
DUPLICAZIONE DEL DNA...................................................................................16
Replicazione semiconservativa del DNA.................................................17
DNA POLIMERASI DI E.COLI..............................................................................................18
I PRIMER DI RNA.........................................................................................................19
Il filamento di DNA è copiato in direzione 5’3’.....................................20
La reazione della DNA-polimerasi..........................................................21
DNA POLIMERASI III È LA REPLICASI DI E.COLI........................................................................23
LA DNA-POL I RIMUOVE I FRAMMENTI DI OKAZAKI....................................................................25
DNA-LIGASI...............................................................................................................26
DNA POLIMERASI I .......................................................................................................26
DNA POLIMERASI DEGLI EUCARIOTI......................................................................................31
FEDELTÀ DI REPLICAZIONE..............................................................................32
LE MUTAZIONI..............................................................................................................33
PERCHÉ È STATO SCELTO IL DNA E NON L’RNA COME MOLECOLA DELL’EREDITARIETÀ...............................35
Idrolisi dell’RNA in condizioni alcaline....................................................36
Deamminazione della citosina ( uracile).............................................37
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ACIDI NUCLEICI
- DNA e RNA
1. Differenze strutturali
2. Differenze funzionali
- Duplicazione del DNA
- Trascrizione
- Traduzione
Controllo dell’espressione genica
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DNA (acido deossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico) sono
molecole polimeriche (polinucleotidi) costituite da un unità base il
NUCLEOTIDE.
I nucleotidi sono delle molecole composte da uno zucchero a 5
atomi di carbonio (ribosio o deossiribosio) da una base azotata e da
un fosfato.
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DNA
RNA
Deossiribosio
Ribosio
Timina
Uracile
Doppia elica
Singola elica
Eccezioni:
 DNA a singola elica (in alcuni virus)
 RNA forma strutture a doppia elica (tRNA)
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FUNZIONI DEL DNA
1. Dirige la propria replicazione durante la divisione cellulare
2. Dirige la trascrizione di molecole complementari di RNA
FUNZIONI DELL’RNA
1. Gli mRNA dirigono la sintesi sui ribosomi delle proteine
(traduzione)
2. Gli RNA dei ribosomi (che sono costituiti 1/3 da proteine e 2/3
da RNA) hanno prob. ruoli funzionali oltre che strutturali
3. Durante la sintesi proteica gli Aa vengono portati ai ribosomi
da molecole di RNA di trasferimento (tRNA)
4. Certi RNA sono associati a proteine specifiche dando luogo a
ribonucleoproteine che partecipano a processi di modificazione
post-trascrizionali di altri RNA
5. In molti virus è l’RNA e non il DNA il vettore dell’informazione
ereditaria
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I NUCLEOTIDI
Struttura dei nucleotidi
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Nel DNA e nell’RNA i nucleotidi sono uniti da legami fosfodiesteri
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DNA: doppia elica antiparallela
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Modello di Watson e Crick
s
1) doppia elica destrorsa fatta da 2 catene antiparallele
2) ogni giro dell’elica vi sono 10,5 coppie di basi e 3,6 nm
(passo)
3) le due catene sono tenute insieme da legami-H, le basi
azotate sono all’interno
4) la sequenza della basi porta l’informazione genetica
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Procarioti
 Niente nucleo
 DNA circolare supervvolto
 Niente istoni
Eucarioti
 Cellule nucleate
 DNA organizzato in cromosomi che contengono 1 unico
filamento di DNA
 Proteine istoniche
Dimensione delle molecole di DNA
E.coli : 4X106 (coppie di basi) 1360 µm (lunghez.)
Uomo (in 23 cromosomi aploidi) 2,9X109 (coppie di basi) 990.000
µm (lunghez.)  2 m  cellula
(in un uomo 1014 cellule) lungheza tot DNA 2 X1011 Km !!
(distanza terra-sole 1,5 X 108 km)
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Organizzazione strutturale superiore del DNA
DNA superavvolto
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Impaccamento dei nucleosomi (fibra 30 nm)
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DUPLICAZIONE DEL DNA
Avviene durante la divisione cellulare. È un processo che coinvolge
una grande quantità di enzimi, tra i principali:
1. DNA girasi (induce un superavvolgimento negativo alla doppia
elica)
2. Proteine che separano i filamenti di DNA alla forcella di
replicazione
3. Proteine che ne impediscono la riassociazione prima che la
replicazione sia avvenuta
4. Enzima per la sintesi del primer di RNA (Primasi)
5. DNA polimerasi
6. Enzima che rimuove i primer di RNA
7. Un enzima che lega covalentemente i frammenti di Okazaki
successivi. (DNA ligasi)
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Replicazione semiconservativa del DNA
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DNA polimerasi di E.coli
1.DNA-pol I: processi di riparazione, eliminazione del primer
2.DNA-pol III : duplicazione del DNA
Promuovono l’allungamento del filamento DNA (5’3’) accoppiando
i deossiribonucleotidi tri-fosfato sullo stampo di DNA
Sono enzimi che necessitano di:
1. deossiribonucleotidi tri-fosfati
2. filamento stampo
3. filamento primer, ovvero una estremità 3’-OH libera
(DNA)
n residui
+ NTP  (DNA)
n +1 residui
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+ PPi
I primer di RNA
Le DNA-pol hanno bisogno di un gruppo 3’-OH libero per poter
allungare la catena.
Come viene iniziata la sintesi di DNA?
La RNA-polimerasi (primasi) NON ha bisogno di primer!!
La primasi è una piccola (60 kDa) RNA-polimerasi che sintetizza
frammenti di RNA di 1-60 (dipende dalla specie) nucleotidi
complementari alla catena stampo che fungono da primer dei
frammenti di Okazaki.
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Il filamento di DNA è copiato in direzione 5’3’
Replicazione semi-discontinua (filamento “veloce” e filamento
“lento”)
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La reazione della DNA-polimerasi
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DNA polimerasi III è la replicasi di E.coli
È un oloenzima di almeno 7 subunità
Altamente processiva (> di 5000 nucleotidi)
Attività:
1. polimerasi 5’→ 3’
2. esonucleasi 3’→ 5’
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Sintesi dei frammenti di Okazaki
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Sintesi della catena veloce e di quella lenta
La DNA-polimerasi-III di E.coli è composta da 2 subunità
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La DNA-pol I rimuove i frammenti di Okazaki
attività esonucleasica 5’3’
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DNA-ligasi
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DNA polimerasi I
è
un
enzima
scarsamente
processivo
(catalizza
circa
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polimerizzazioni successive prima di staccarsi) ma con una bassa
frequenza di errore (10-7). In aggiunta ai sistemi di riparazione si
arriva a 10-10!
La DNA pol. I può correggere i propri errori è una
1. esonucleasi 3’→ 5’
2. esonucleasi 5’→ 3’
La funzione fisiologica della DNA-pol I è quella di:
1. riparare il DNA danneggiato (basi modificate chimicamente e
quindi non correttamente appaiate)
2. eliminare i primer di RNA durante la replicazione
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DNA-pol-I
Attività esonucleasica 5’3’
riparazione DNA
eliminazione primer di RNA
Attività esonucleasica 3’5’
“lettura di sicurezza”; verifica il
corretto appiamento della base
precedente prima di aggiungere
la successiva
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DNA polimerasi degli eucarioti
Sono note 5 diverse polimerasi:
pol-α (alfa):
oligomero a localizzazione nucleare; partecipa alla dupl. del DNA ;
ad essa è associata una attività primasica; non ha attività
esocucleasica; processività limitata (circa 100 nucleotidi)
Ip.: replicazione del filamento ritardato (necessita di molti primer
ma di una bassa processività)
pol- γ (gamma):
enzima mitocondriale
pol-δ (delta):
enzima nucleare; partecipa alla dupl. del DNA ha attività
esonucleasica 3’ 5’ ; processività illimitata.
Ip.: replicazione del filamento leader (necessita di pochi primer e
alta processività)
pol-ε (epsilon):
enzima nucleare; è implicata nei processi di riparazione del DNA
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FEDELTÀ DI REPLICAZIONE
La fedeltà di replicazione del DNA è necessaria per preservare
l’integrità del messaggio genetico di generazione in generazione.
La DNA-pol III di E.coli polimerizza una base sbagliata ogni 1081010 basi replicate. (1 errore ogni 1000 batteri per ogni
generazione).
Ragioni di questa elevatissima accuratezza:
1. lettura di sicurezza e attività esonucleasica 3’→ 5’
2. necessità di un primer (i primi nucleotidi di una catena ad
essere appaiati sono più soggetti ad un errato appaiamento tra
le basi)
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Le mutazioni
1. sostituzione di basi (mutazioni puntiformi)
2. inserzione o delezione di basi (frame shift)
mutazioni puntiformi:
1. transizioni (purina sostituisce purina o pirimidina sostituisce
pirimidina)
2. transversioni (purina sostituisce pirimidina viceversa)
A) tautomero raro della adenina che si appaia con la citosina
(invece che con la timina)
A-T
A-T
A*-C
A-T
G-C DNA mutato !!
A-T
A-T
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B) bromo-uracile (analogo della timina) si appaia con l’adenina;
con una certa frequenza si lega alla Guanina  mutazione.
C) deaminazione della citosina
deaminazione
G-C
replicazione
G-U
G-C
A-U
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DNA mutato !!
Perché è stato scelto il DNA e non l’RNA come
molecola dell’ereditarietà
1. RNA ma non il DNA è suscettibile di idrolisi catalizzata da basi.
Quindi il DNA è una molecola chimicamente più stabile.
2. Il DNA non risente della deaminazione della citosina (ad
Uracile) perché esso non contiene Uracile (ma Timina)
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Idrolisi dell’RNA in condizioni alcaline
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Deamminazione della citosina (→ uracile)
deamminaz
G=C

duplicazione
G=U
A=U DNA mutato !!

G=C
Se accade questa deamminazione si ha una mutazione ma siccome
l’uracile NON è una base del DNA viene eliminato dai sistemi di
riparazione
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