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MECCANISMI DI CATALISI
Ogni enzima ha un suo specifico meccanismo catalitico ma spesso più
meccanismi si integrano:
1) CATALISI PER EFFETTO DI PROSSIMITA’ E ORIENTAMENTO
2) CATALISI DA LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI TRANSIZIONE
3) CATALISI ACIDO-BASE
4) CATALISI COVALENTE
5) CATALISI MEDIANTE IONI METALLICI
I primi due meccanismi sono comuni a tutti gli enzimi
CATALISI favorita dalla PROSSIMITA’ e dall’ORIENTAMENTO:
1) Gli enzimi bloccando il substrato nel sito di legame aumentano la
prossimità dei gruppi funzionali che devono reagire (è come se
aumentassimo la concentrazione dei reagenti nel sito attivo)
2) diminuisce la libertà di movimento e quindi l’entropia dei reagenti,
l’energia necessaria a compensare questo aumento di ordine del sistema
è fornita dalla formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il
substrato.
CATALISI favorita dal LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI
TRANSIZIONE
il sito attivo dell’enzima di adatta perfettamente al substrato quando
viene raggiunto lo stato di transizione:
la complementarietà abbassa la ΔG‡ e accelera la trasformazione
CATALISI ACIDO-BASE
Trasferimento di ioni H+ o OH- dal o al substrato
e comporta la rottura di legami
Favorisce quelle reazioni in cui si forma un intermedio carico instabile
Specifica: quando l’accettore o il donatore di ioni H+ o OH- è l’H2O
Generale: quando sono coinvolte
le catene laterali ionizzabili
di residui amminoacidici del sito
Catalitico. I pKa di tali residui
possono variare molto rispetto
a quelli dei singoli amminoacidi
in soluzione.
Comporta la formazione di intermedi in cui il
substrato è legato covalentemente con un residuo
amminoacidico del sito attivo dell’enzima.
CATALISI
COVALENTE
La catena laterale reattiva dell’enzima può comportarsi sia da nucleofilo che da elettrofilo. La
più comune è la catalisi nucleofila (un gruppo funzionale dell’enzima si comporta da
nucleofilo):
Enz-R-O—
S
Enz-R-O-S
H2O
Enz-R-OH + P
CATALISI TRAMITE IONI METALLICI
quando nel sito attivo sono presenti ioni metallici che servono a:
• stabilizzare lo stato di transizione
• proteggere cariche negative (Mg2+ nelle chinasi scherma le cariche
negative dell’ATP e facilita l’attacco nucleofilo del substrato al fosforo)
• orientare il substrato
• partecipare a reazioni di ossido-riduzione
METALLO-ENZIMI: metallo di transizione legato fortemente all’enzima (Fe,
Cu, Mn, Zn, Co)
ENZIMI ATTIVATI DA METALLI: legano debolmente un metallo alcalino o
alcalino-terroso
Trioso-fosfato isomerasi (TPI)
Rapida interconversione del DHAP
in G3P.
Il meccanismo proposto comporta
il trasferimento di H+ dal C-1 al C-2
del DHAP.
Meccanismo di catalisi acido-base
generale
1
2
3
Diidrossiacetonefosfato
(DHAP)
Gliceraldeide
3-fosfato (G3P)
Il diidrossiacetonefosfato (DHAP)
forma un legame H con l’His-95
dell’enzima.
H
H
Il Glu-165 rimuove un protone
dal C-1 del DHAP.
Si avvia un riarrangiamento
elettronico che porta l’ossigeno
del carbonile in C-2 del DHAP a
strappare un H+ all’His95
La rimozione dell’H+ dal C-1 porta alla formazione di un intermedio enediolo. L’His-95
rilascia un H+ all’Ossigeno in C-2 con cui è legata: l’anello imidazolico diventa
“imidazolato”.
L’His carica negativamente forma un
forte legame H con l’OH in C-1 e infine
gli strappa un protone
Il Glu-165 cede
l’H+ sul C-2
2
J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2012
Si forma un carbonile in posizione
1: si ottiene gliceraldeide-3-fosfato
e l’enzima ritorna nel suo stato
originario
H
Rimozione dell’anione radicale superossido
(·O2-)
L’anione superossido è un prodotto secondario e tossico del metabolismo ossidativo e può
essere prodotto ad alti livelli in caso di stress ossidativo causato da stati infiammatori e
allergici, patologie specifiche, fumo, radiazioni, farmaci…
Superossido dismutasi (SOD)
Nel sito attivo è presente un
profondo canale idrofilico alla base
del quale è presente uno ione Cu2+
L’anione superossido è indirizzato all’interno del
canale e trattenuto per effetto elettrostatico
1° step: entra il 1° ·O2- che riduce il Cu2+
E-Cu2+ + ·O2- → E-Cu+ + O2
2° step: entra il 2° ·O2- che ossida il Cu+
E-Cu+ + ·O2- + 2H+ → E-Cu2++ H2O2
SOD
4 ·O2-
2O2 + 2H2O2
4H+
Rimossa dalla catalasi o dalla
glutatione-perossidasi
2H2O + O2
REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
- Regolazione a lungo termine: la quantità di enzima può essere controllata
regolando la velocità della sua sintesi o degradazione (minuti o ore)
- Regolazione a breve termine (secondi o frazioni di secondo): l’attività enzimatica
varia in funzione di stimoli ambientali, primo fra tutti la concentrazione di substrato
e di prodotto, in secondo luogo attraverso dei meccanismi di modulazione
(regolazione).
Gli enzimi che subiscono modulazione controllano
passaggi chiave delle vie metaboliche, perciò vengono
anche detti: Enzimi regolatori
MODULAZIONE ALLOSTERICA NON-COVALENTE (REVERSIBILE)
MODULAZIONE COVALENTE (REVERSIBILE o IRREVERSIBILE)
MODULAZIONE COVALENTE: l’enzima subisce una modificazione post-traduzionale ad
opera di altri enzimi (MODIFICATORI) che a loro volta possono essere regolati.
Ad opera di
Modificazioni più comuni:
fosforilazioni (su residui di Ser, Thr, Tyr, His) ► Chinasi
► Acetilasi
acetilazione (Lys, Ammino-terminale)
► Proteosoma
ubiquitinazione (Lys)
► Metilasi
metilazione (Lys, Arg)
SerinaChinasi
+ ATP
+ ADP
Enzima da regolare
------ VSQEE-----Residuo di Ser da
fosforilare
Enzima fosforilato
------ VSQEE-----CH2
Ι
O
Ι
-O–P=O
Ι
O-
La fosforilazione di residui di Ser, Thr, Tyr o His è la forma più comune di
modulazione covalente: è controllata da chinasi e fosfatasi
Una proteina-chinasi trasferisce
un gruppo fosforico dall’ATP sul
sito di fosforilazione dell’enzima
Una proteina-fosfatasi rimuove il
gruppo fosforico dall’enzima.
Proteina-chinasi e proteinafosfatasi sono a loro volta
regolate e in genere inserite in
una cascata di fosforilazioni
innescate da un segnale.
2 subunità
ciascuna con un
sito di
fosforilazione
Glicogenofosforilasi b
(meno attiva)
Fosforilasifosfatasi
Fosforilasichinasi
LA FOSFORILAZIONE PUÒ
INIBIRE O ATTIVARE
L’ENZIMA.
Glicogenofosforilasi a
(più attiva)
DEGRADAZIONE DEL GLICOGENO
ZIMOGENI
MODULAZIONE COVALENTE MEDIANTE TAGLIO PROTEOLITICO
Enzimi prodotti in forma inattiva che vengono attivati solo dopo aver subito un taglio
proteolitico che avviene solo nel momento e nella sede opportuni
Cascata di attivazione delle proteasi pancreatiche
Prodotta dalla mucosa
del duodeno
attiva
attiva
attiva
attiva
attiva
MODULAZIONE ALLOSTERICA NON-COVALENTE
Enzimi allosterici: attività catalitica influenzata da cambiamenti strutturali
Aggiungendo ancora
substrato:
transizione T > R
completa
1) Hanno più subunità e più siti
attivi per il substrato
2) Legano le molecole di substrato
in modo cooperativo
3) Subiscono una transizione dallo
stato T allo stato R
4) NON seguono la cinetica di
Michaelis-Menten
Assenza di substrato
Enzima
stato T
meno affine
[S] aumenta: Il legame con le prime molecole di S
induce cambiamenti conformazionali che convertono
in modo cooperativo le subunità dell’enzima dallo
stato T allo stato R
Substrato = modulatore omotropico positivo dell’enzima
Gli enzimi allosterici possono essere
regolati controllando la concentrazione di
substrato
S
ET
Il substrato influenza l’equilibrio fra stato
a bassa affinità e stato ad alta affinità.
L’affinità dell’enzima per il
substrato è data dalla K0.5
E RS
S
Vmax
[S] che permette di raggiungere
metà della Velocità massima di
reazione
Equazione cinetica:
v0 =
Vmax [S]n
K0.5n + [S]n
K0.5
Regolazione eteroallosterica
MODULATORI ALLOSTERICI POSITIVI (ATTIVATORI)
MODULARORI ALLOSTERICI NEGATIVI (INIBITORI)
Possono modificare la K0,5 o la Vmax o entrambe
Cambia la K0,5 ma non la Vmax
+ attivatore
Cambia la Vmax ma non la K0,5
+ attivatore
+ inibitore
+ inibitore
Modulatori eteroallosterici
1) Si legano in siti diversi dal sito attivo = SITI REGOLATORI.
2) Il legame con il modulatore altera la struttura dell’enzima che nella nuova
conformazione ha proprietà cinetiche differenti.
3) Il legame modulatore/enzima è sempre NON-covalente e reversibile.
4) Un inibitore allosterico favorisce
la forma dell’enzima con minore
affinità per il substrato
stabilizzandola.
5) Un attivatore allosterico
favorisce la forma R dell’enzima
rendendola molto più affine al
substrato
Sito
catalitico
Sito
regolatore
substrato
Attivatore
Enzima Stato T
inattivo
Legame con attivatore
Enzima Stato R
Complesso Enzima
attivo-substrato
Segnale extracellulare trasdotto attraverso la
membrana plasmatica attiva l’adenilato ciclasi.
PPi
ATP
Adenilato ciclasi
AMP ciclico
(5’3’-adenosina-monofosfato)
Attivatore allosterico della PKA (proteinachinasi A, fosforila varie proteine target)
PKA: 2 domini REGOLATORI (ciascuno con 2 siti di legame per il cAMP)
2 domini CATALITICI
PKA attiva
PKA inattiva
PKA attiva
Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2007
La modulazione di un enzima allosterico è
utilizzata nel meccanismo della
RETROINIBIZIONE (inibizione a feed back)
In un processo metabolico multistep il primo
enzima della via è un enzima allosterico che viene
inibito allostericamente dal prodotto che si
ottiene nell’ultima reazione della via.
Sintesi di Isoleucina a partire da Treonina:
processo in 5 reazioni.
La prima è catalizzata dalla treonina deidratasi
che è inibita allostericamente dalla Isoleucina