Transcript Spectrometrie

Spectrometrie
SPECTROSCOPISCHE DETECTIE IN
DE VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE:
Deel lib
H.
LINGEMAN
VRIJE UNIVERSITEIT, VAKGROEP ANALYTISCHE CHEMIE,
DE BOELELAAN 1083, 1081 HV AMSTERDAM, TEL,: 20 444 7539
2.2 S T A N D A A R D E N
DEN
EN
CALIBRATIEMOGELIJKHE-
De meeste laboratoria werken met erkende
standaarden
die
gecertificeerd
z i j n a l s o v e r e e n k o m e n d m e t B S 5 7 5 0 of
ISO
9000.
Farmaceutische
laboratoria
m o e t e n o p e r e r e n v o l g e n s d e F D A (Food and
D r u g A d m i n i s t r a t i o n ) o p g e s t e l d e 'Code of
F e d e r a l r e g i s t e r ' . D e G L P (Good L a b o r a tory Practice) en GMP
(Good M a n u f a c t u ring P r a c t i c e ) r i c h t l i j n e n m o e t e n eveneens
opgevolgd
worden.
Deze
laatste
richtlijnen b e p a l e n dat alle instrumenten regelmatig gecalibreerd en gecontroleerd m o e t e n w o r d e n .
Terwijl
er
duidelijke
richtlijnen
zijn
om
chromatografische
systemen
te
testen met b e h u l p v a n p i e k asymmetrie en
p i e k e f f i c i ë n t i e m e t i n g e n is e r m i n d e r
bekend over het calibreren van spectrometers. Er bestaat een 'American National
Standard'
(Standard
Practice
for
Testing
Fixed
Wavelength
Photometric
D e t e c t o r s U s e d in L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y
E 685 - 7 9 ) m a a r d e z e h o u d t z i c h m e t n a m e
b e z i g m e t h e t c o n t r o l e r e n v a n d e r u i s en
de
drift
van
het
instrument
en
niet
zozeer met de spectrometrische nauwkeurigheid en p r e c i s i e . Waarschijnlijk
is
het b e t e r o m e e n U V d e t e c t o r n i e t a l s
een
conventionele
spectrometer
te
beschouwen,
omdat
de traditionele
standaarden
hier
moeilijk
gebruikt
kunnen
worden (doorstroomcel versus cuvethouder
met
cuvetten).
Bovendien
kunnen
een
aantal LC d e t e c t o r e n geen spectra scannen en zijn ze u i t g e r u s t met een 'autozero ' f u n c t i e
die
iedere keer
als
de
golflengte
verandert
wordt
in
werking
treedt. De standaarden voor conventionele s p e c t r o m e t e r s g e v e n d a n o o k n i e t m e e r
dan een aardig startpunt om
calibratie
routines uit te voeren.
2.2.1 Wat moet er gecalibreerd worden?
Bij
een
conventionele
spectrometer
wordt de golflengte en de fotometrische
nauwkeurigheid gecontroleerd. Aanvullende controles met b e t r e k k i n g o p s t r o o i licht en r e s o l u t i e w o r d e n v a a k a a n b e v o len. V o o r een L C d e t e c t o r z i j n o o k de
ruis
en
drift
belangrijke
parameters
omdat
deze
apparaten
vaak
worden
gebruikt om een a b s o r p t i e s i g n a a l
continu
over een langere p e r i o d e te v o l g e n .
Literatuur:
Standaarden
die
voor
calibratiedoeleinden
gebruikt
kunnen
worden
zijn beschreven
in:
C. Burgess
and A . Knowles
(Eds.),
Standards in Absorption
Spectrometry,
Chapman
and Hall,
London,
1981.
B.J.
Clark,
T. Frost
and
M.A.
Russell
(Eds.),
UV
Spectroscopy:
Techniques,
Instrumentation
and Datahandling,
Chapman and Hall,
London,
1993.
2.2.2 Golflengte nauwkeurigheid
Bij
een
conventionele
spectrometer
kan de nauwkeurigheid van de golflengte
gecontroleerd
worden
door
het
scannen
van
het
spectrum
van
een
verbinding
waarvan de plaats van de absorptiemaxima
precies
bekend
is.
De
standaard
die
h i e r v o o r h e t m e e s t w o r d t g e b r u i k t is e e n
5% (m/v) o p l o s s i n g v a n h o l m i u m p e r c h l o r a a t in p e r c h l o o r z u u r ( F i g u u r 1 4 ) .
Het spectrum van d e z e v e r b i n d i n g
bevat
een
aantal
scherpe
lijnen
waarvan
de
golflengten
nauwkeurig
bekend
zijn.
Omdat niet
alle LC detectoren
spectra
kunnen scannen moet hiervoor een andere
methode worden toegepast.
Een b e n a d e r i n g is d o o r g e b r u i k t e m a ken van het feit dat de d e u t e r i u m l a m p ,
d i e m e e s t a l in d e d e t e c t o r a a n w e z i g i s ,
enkele scherpe
lijnen heeft
bij
656,3
nm,
486,1
nm
en
379,9
nm.
Indien
de
detector het m o g e l i j k m a a k t om d e e n e r gie van de deuteriumlamp te m o n i t o r e n ,
kan
de
maximum
emissie
bij
656,3
nm
worden
gecontroleerd.
De
golflengte
wordt dan gevarieerd totdat het e n e r g i e maximum
wordt
bereikt
hetgeen
dan
op
656.3 nm m o e t l i g g e n . E e n a f w i j k i n g van
i 1 nm v o o r het UV g e b i e d en ± 3 nm v o o r
het V I S g e b i e d is n o g a c c e p t a b e l .
Figuur 14: Spectrum van holmium perchloraat.
Attentie!
Om dit
te kunnen
doen
moet
de spectrometer
in
de energiemode
kunnen
werken.
Het is absoluut
geen
goede
manier
om het
absorptiemaximum
bij
656,3
nm
vast
te
stellen,
omdat
absorptie
alleen
een maat
is
voor
de
verhouding
van de energie
van de lichtbundel
voor
en na de
doorstroomcel.
Helaas b e s c h i k k e n d e m e e s t e UV d e t e c t o r e n n i e t o v e r e e n e n e r g i e m o d e . In d a t
geval
zal er een
andere techniek
gebruikt m o e t e n w o r d e n . Een
mogelijkheid
is o m d e d o o r s t r o o m c e l t e v u l l e n m e t e e n
oplossing
van
holmium
perchloraat
en
vervolgens het spectrum van de belangr i j k s t e b a n d e n t e s c a n n e n . D i t is e c h t e r
nagenoeg
onmogelijk
bij
apparaten
die
een a u t o m a t i s c h e a u t o - z e r o f u n c t i e h e b ben.
Een andere benadering die wel
wordt
toegepast
is
om
een
chromatogram
van
methylhydroxybenzoaat
en fenetol op te
nemen. Het spectrum van deze twee verb i n d i n g e n is t e z i e n in F i g u u r 1 5 .
Fig. 15: Spectrum van methylhydroxybenzoaat en fenetol
Deze twee spectra snijden elkaar bij 264
nm. E e n c h r o m a t o g r a m v a n d e z e t w e e v e r b i n d i n g e n w o r d t g e g e n e r e e r d b i j 264 nm.
Een voorbeeld van een chromatogram met
d e h i e r b i j h o r e n d e c o n d i t i e s i s in F i guur
16
gegeven.
De
concentratie
van
b e i d e v e r b i n d i n g e n in h e t m e n g s e l w o r d t
zo g e k o z e n d a t d e p i e k e n in h e t c h r o m a togram o n g e v e e r e v e n h o o g z i j n . Het feit
dat d e p i e k e n v a n g e l i j k e h o o g t e m o e t e n
z i j n k a n nu g e b r u i k t w o r d e n o m d e g o l f lengte te controleren.
Figuur 16: Chromatogram van methylhydroxybenzoaat en
fenetol. Kolom, Spherisorb 5 0DS (100 x 4,6 mm I.D.);
Eluens, methanol - water - fosforzuur (500/500/1, v / v ) ;
Detectie, 264 nm.
D i t o m d a t u i t F i g u u r 16 k a n w o r d e n a f g e lezen dat bij iedere g o l f l e n g t e , behalve
2 6 4 nm,
de molaire
absorpties van
de
twee
verbindingen
totaal
verschillend
zijn en de p i e k h o o g t e dus verschillend
zal z i j n .
Het
chromatogram
kan
verder
gebruikt
worden om een aantal andere parameters
te controleren zoals de reproduceerbaarh e i d v a n d e i n j e c t o r . I n j e c t i e v a n dit
m e n g s e l m a a k t h e t d u s m o g e l i j k o m het
gehele chromatografisch systeem,
inclusief d e d e t e c t o r , t e c o n t r o l e r e n .
cm w a a r d e k a n d a n w o r d e n
vergeleken
met de getallen uit Tabel X I I .
2.2.3 Fotometrische
Literatuur:
Het
fenomeen
wordt
uitgebreid
besproken
C. Burgess
and A . Knowles
Standards
in
Absorption
Chapman
and Hall,
London,
nauwkeurigheid
De
fotometrische
nauwkeurigheid
van
een c o n v e n t i o n e l e s p e c t r o m e t e r wordt met
behulp v a n v a s t e of v l o e i b a r e standaard e n b e p a a l d . In e e n L C d e t e c t o r k u n n e n
alleen vloeibare standaarden worden geb r u i k t . D e m e e s t g e b r u i k t e s t a n d a a r d is
een oplossing van kalium dichromaat
in
zwavelzuur.
De
absorptie
hiervan
is
n a u w k e u r i g b e k e n d e n t e r u g t e v i n d e n in
de
Nederlandse
en
Engelse
Farmacopee
(Tabel X I I ) .
Tabel XII: Absorptiegegevens van kaliumdichromaat
2.2.4 Strooilicht
Strooilicht
is l i c h t m e t
een
andere
golflengte dan de gewenste
golflengte.
In L C is h e t g e v o l g v a n s t r o o i l i c h t e e n
verminderde gevoeligheid en een beperkt
lineair dynamisch b e r e i k . E e n meer uitgebreide
bespreking
van
het
fenomeen
s t r o o i l i c h t is i n p a r a g r a a f 2 . 4 t e v i n den.
strooilicht
in:
(eds.),
Spectrometry,
1984.
Strooilicht wordt meestal bepaald met
behulp van f i l t e r s m e t e e n s c h e r p e 'cutoff
waarde.
Deze
benadering
kan
ook
gebruikt worden bij LC detectoren.
Er
zijn een aantal o p l o s s i n g e n v a n a n o r g a nische zouten die gebruikt kunnen worden
om s t r o o i l i c h t
te meten
(Tabel
XIII).
Een verzadigde
waterige
oplossing
van
lithium carbonaat heeft een scherpe cutoff bij c a . 225 nm e n e e n w a t e r i g e o p l o s i n g (10 g.l" ) h e e f t e e n s c h e r p e
'cuto f f bij 260 nm.
1
Golflengte
(nm)
Een kalium dichromaat standaard kan relatief e e n v o u d i g w o r d e n g e b r u i k t om LC
detectoren te c a l i b r e r e n , maar er moet
in d e g a t e n w o r d e n g e h o u d e n d a t d e b a n d breedte van detectoren vaak groter
is
dan van c o n v e n t i o n e l e spectrometers met
a l s g e v o l g d a t d e m o l a i r e a b s o r p t i e s (e
of E ,
niet
in a l l e g e v a l l e n
gebruikt mogen w o r d e n .
De volgende procedure kan worden toegepast. De golflengte wordt ingesteld op
één van de w a a r d e n uit Tabel X I I . De
doorstroomcel wordt gevuld met een oplossing v a n
0,005 M
zwavelzuur
en
de
detector wordt op nul gezet. Vervolgens
wordt
de d o o r s t r o o m c e l
gevuld met
een
oplossing
van
kalium
dichromaat
(60
mg.r
in 0 , 0 0 5 M z w a v e l z u u r ) e n d e a b sorptie wordt gemeten. De berekende
Het experiment
wordt
op de
volgende
manier uitgevoerd. De detectorcel wordt
gevuld met w a t e r en op 0 g e z e t . D e cel
wordt vervolgens gevuld met een o p l o s sing van het g e s c h i k t e ' c u t - o f f
filter
en de a b s o r p t i e w o r d t g e m e t e n . I n d i e n er
een
overmaat
aan
strooilicht
aanwezig
is,
zal
de
absorptie
verminderen
en
wordt s t r o o i l i c h t g e m e t e n , In het a l g e meen zullen strooilichtfilters
een absorptie van > 2 geven.
Tabel XIII: Cut-off filters voor strooi1ichtmetingen
1 %
1
Zoutoplossing
Golflengtegebied
(nm)
2.2.5 Lineariteit
2.2.6 Ruis en drift
Een
kalium
dichromaatoplossing
kan
ook gebruikt w o r d e n om de
lineariteit
van
een
detector
te
controleren.
Met
behulp van oplossingen met verschillende
concentraties wordt een
calibratiecurve
gemaakt w a a r i n de a b s o r p t i e wordt u i t g e zet t e g e n d e c o n c e n t r a t i e . D e c u r v e m o e t
l i n e a i r z i j n t o t e e n e x t i n c t i e v a n 1.5
of m e e r . S t r o o i l i c h t is b o v e n d e z e w a a r de, a f h a n k e l i j k v a n d e g e b r u i k t e optiek,
de b e p e r k e n d e f a c t o r .
Een LC detector moet een stabiel sign a a l g e v e n d a t v r i j is v a n e x t r e m e r u i s
en d r i f t . R u i s e n d r i f t k u n n e n o p d e
volgende manier worden onderverdeeld:
De
spectrale
spleetbreedte
van
een
spectrometer heeft
invloed op de
vorm
van de absorptieband en op de lineariteit v a n d e c a l i b r a t i e c u r v e . D e z e p a r a meters kunnen worden gecontroleerd
aan
de h a n d v a n h e t s p e c t r u m v a n b e n z e e n - ( damp) (Figuur 1 7 ) .
Figuur 17: Invloed van de spectrale spleetbreedte op de
vorm van de absorptieband (benzeen) en op de lineariteit van de ijklijn.
•
D r i f t is h e t c o n t i n u o p - o f
aflopen
v a n d e b a s i s l i j n . H e t g e v o l g is d a t
kleine
pieken
niet
meer
zichtbaar
zijn en dat a u t o m a t i s c h e p i e k i n t e g r a tie bemoeilijkt wordt;
• Laaq-frequente
ruis
is
de
maximum
respons
van
de
detector
voor
alle
random variaties van het detectorsignaal met frequenties van 6 - 6 0
cycli
per uur. Het
is h e t
soort ruis
dat
gemakkelijk
verward
kan
worden
met
laat e l u e r e n d e p i e k e n ;
• Hooq-frequente
ruis
is
de
maximum
respons
van
de
detector
voor
alle
random variaties van het detectorsignaal
met
frequenties
groter
dan
1
cyclus per minuut.
Beide parameters kunnen relatief eenvoudig
worden
gemeten
door
de
detector
gedurende een bepaalde tijd, op de maximale gevoeligheid, zonder te injecteren,
aan te laten staan en het signaal op een
recorder te r e g i s t r e r e n . Om het
geheel
z i n v o l u i t t e v o e r e n m o e t h e t s y s t e e m in
evenwicht zijn en m o e t de m o b i e l e fase
zo w e i n i g m o g e l i j k a b s o r p t i e v e r t o n e n .
Literatuur:
In
onderstaande
referentie
wordt
aanbevolen
om
methanol
te
gebruiken
als
eluens
en verder
worden
er
details
gegeven
om
zowel
de
laag
als
hoog frequente
ruis en drift
te
meten:
Standard
Practice
for
Testing
Fixed
Wavelength
Photometric
Detectors
Used
in
Liquid
Chromatography
E685
-79.
2.2.7 Wanneer moet er gecalibreerd
den?
Naarmate
de
spectrale
spleetbreedte
g r o t e r is g a a t m e e r d e t a i l v e r l o r e n . D e
spleetbreedte moet zodanig worden ingesteld d a t b i j v e r d e r e v e r k l e i n i n g e r v a n
de e x t i n c t i e n i e t m e e r v e r a n d e r t .
wor-
O p d e z e v r a a g is g e e n e e n v o u d i g a n t w o o r d t e g e v e n . In h e t a l g e m e e n k a n g e zegd w o r d e n dat n i e u w e i n s t r u m e n t e n en
instrumenten die zijn verplaatst gecalibreerd moeten worden en dat er op vaste
tijdstippen zoals i e d e r e m a a n d of ieder
jaar (afhankelijk v a n het g e b r u i k ) g e c a libreerd moet w o r d e n . Zodra een instrument regelmatig wordt gecontroleerd
en
goed bevonden kan de p e r i o d e t u s s e n twee
controles worden verlengd. Ieder laboratorium zal e c h t e r een e i g e n c a l i b r a t i e -
schema moeten opstellen
de eigen voorschriften,
ratuurgebruik, enz•
afhankelijk van
werklast, appa-
2.3 KWANTITATIEVE BEPALINGEN
D o e l v a n e e n k w a n t i t a t i e v e a n a l y s e is
de c o n c e n t r a t i e van een verbinding, vaak
in a a n w e z i g h e i d v a n a n d e r e c o m p o n e n t e n ,
nauwkeurig te b e p a l e n . Uit de Wet van
Lambert-Beer
volgt
dat
hiervoor
een
n a u w k e u r i g e m e t i n g v a n E in d e
doorstroomcel voldoende kan zijn. De weglengte van de doorstroomcel
is e c h t e r
meestal
een
onbekende
factor
hetgeen
b e t e k e n t d a t in L C
relatieve metingen
ten opzichte van een standaard
uitgevoerd moeten worden.
Men begint een kwantitatieve bepaling
met
de
controle
van
de
te
gebruiken
reagentia en o p l o s m i d d e l e n . Het eenvoud i g s t e is o m e e n b l a n c o b e p a l i n g t e v e r r i c h t e n , d a t is h e t u i t v o e r e n v a n e e n
LC-bepaling zonder dat de te onderzoeken
verbinding
wordt
geïnjecteerd.
De
extinctie van een dergelijke blanco mag
n i e t h o g e r z i j n d a n 0,4 e n m o e t l i e f s t
l a g e r z i j n d a n 0,2
(zie o o k p a r a g r a a f
2 . 4 ) . Indien bijvoorbeeld een derivatiseringsreactie wordt uitgevoerd moet ook
worden
gecontroleerd
of
er
bij
deze
r e a c t i e g e e n a n d e r e p r o d u c t e n , d a n het
derivaat, ontstaan die een te hoge achtergrondabsorptie geven. Vervolgens moet
worden gecontroleerd of de calibratiec u r v e in h e t g e b i e d w a a r g e m e t e n g a a t
worden
wel
een
rechte
is. Er
moeten
minimaal
drie
verdunningen worden
geïnjecteerd
in h e t g e v a l d e c u r v e
een
r e c h t e is e n m e e r p u n t e n i n d i e n d e c u r v e
een kromme blijkt te zijn. Om gegevens
over de herhaalbaarheid en/of reproduceerbaarheid te verkrijgen moeten injecties 5 - 8 maal worden herhaald. Er moet
worden vastgesteld dat onder de meetomstandigheden wordt v o l d a a n aan de voorwaarden waarvoor de Wet van Lambert-Beer
is a f g e l e i d
(geen o n d e r l i n g e b e ï n v l o e ding, m o n o c h r o m a t i s c h e straling, e n z . ) .
De m e e t p r o c e d u r e bestaat uit een aantal stappen. A l l e r e e r s t moet de extinct i e v a n e e n b l a n c o w o r d e n g e m e t e n (zie
b o v e n ) e n v e r v o l g e n s m o e t d e b l a n c o , al
dan niet met b e h u l p van de auto-zero,
worden ingesteld. Vervolgens moet gecontroleerd w o r d e n of d e s p l e e t b r e e d t e niet
te groot of te klein is. Hierna worden
de s t a n d a a r d e n g e ï n j e c t e e r d . Door m e t i n -
gen
aan weerszijden
van
de
opgegeven
golflengte stelt m e n vast of de m e t i n g
inderdaad
in
het
absorptiemaximum
plaatsvindt.
In
het
absorptiemaximum
verandert
de
extinctie
namelijk
het
sterkst met de c o n c e n t r a t i e t e r w i j l de
invloed van de s p e c t r a l e
spleetbreedte
het k l e i n s t is (zie o o k p a r a g r a a f 2 . 4 ) .
Ten slotte kunnen de c a l i b r a t i e en de
onbekende m o n s t e r s w o r d e n g e m e t e n . Na de
meting worden een aantal blanco injecties uitgevoerd om het hele systeem weer
schoon te spoelen.
Als meer dan één absorberende verbinding aanwezig is, b i j v o o r b e e l d indien de
chromatografische
resolutie
niet
voldoende
is, en
er
is
geen
golflengte
waarbij alleen de te bepalen
component
a b s o r b e e r t , d a n is h e t t o c h m o g e l i j k o m
de concentratie v a n de a a n w e z i g e componenten te bepalen met
behulp van
een
meerpuntsmeting. Er moet
in d i t
geval
wel een DAD of een d e t e c t o r d i e m i n i m a a l
twee
golflengten
simultaan
kan
meten
worden gebruikt. Er worden extinctiemetingen
uitgevoerd bij zoveel golflengten als er a b s o r b e r e n d e s t o f f e n aanwezig
zijn. Voor een m e n g s e l van t w e e stoffen
A en B v e r l o o p t d e a n a l y s e a l s v o l g t . De
extinctie van het m e n g s e l wordt gemeten
bij twee g o l f l e n g t e n X en X . Hiervoor
geldt:
}
2
Als X
en X
zo w o r d e n g e k o z e n d a t e
(X,,A) * e (Xj,B) e n e (X ,A)
* e (X ,B),
k u n n e n u i t d e z e V e r g e l i j k i n g e n c (A) e n
c (B) w o r d e n o p g e l o s t . D e s a m e n s t e l l i n g
van
een
twee-componentenmengsel
kan
veelal met voldoend hoge nauwkeurigheid
worden vastgesteld. Bij aanwezigheid van
meer componenten neemt de onnauwkeurigheid snel toe omdat s t e e d s m e e r
extincties moeten worden bepaald en de
fout in e l k e e x t i n c t i e m e t i n g
bijdraagt
a a n d e f o u t in d e b e r e k e n d e c o n c e n t r a tie.
{
2
2
2
2.3.1 Detectiegrenzen
De laagste concentratie die met b e hulp van UV kan w o r d e n g e m e t e n met conventionele UV-spectroscopie
kan
worden
berekend met behulp van vergelijking 11:
W o r d t v o o r e e e n w a a r d e v a n 1 0 . 0 0 0 , en 1
cm v o o r 1 g e n o m e n , d a n l i g t d e z e c o n c e n tratie bij 2 x 1 0 g / 1 . Voor LC-UV bepalingen gaat d e z e v e r g e l i j k i n g niet op en
kan een s c h a t t i n g v a n de l a a g s t e c o n c e n tratie die gemeten kan worden
gemaakt
worden met behulp van vergelijking 12:
5
Met b o v e n s t a a n d e formule kan het verband
tussen de geïnjecteerde hoeveelheid van
een v e r b i n d i n g
(Q in g ) e n d e b i j het
p i e k m a x i m u m g e v o n d e n e x t i n c t i e (E) w o r den berekend u i t g a a n d e v a n een optische
w e g l e n g t e v a n 1 cm. V
is het r e t e n t i e volume ( m l ) , E ! ^ de specifieke extinct i e v a n d e v e r b i n d i n g in h e t b e t r e f f e n d e
eluens en bij de g e b r u i k t e golflengte en
N
het
schotelgetal
van
de
gebruikte
kolom. Stel dat het r e t e n t i e v o l u m e van
de v e r b i n d i n g 6 m l i s , h e t s c h o t e l g e t a l
van de kolom 2.000 en de gemeten e x t i n c t i e 0,1 d a n m o e t e e n h o e v e e l h e i d v a n
3,4 x 10" / E ,
g worden
geïnjecteerd
om e e n p i e k m e t d e g e w e n s t e e x t i n c t i e t e
verkrijgen. Bij
een
injectievolume
van
10 ful b e t e k e n t d i t d a t e e n o p l o s s i n g v a n
3.400 / E
mg/100 ml moet worden gebruikt.
gram op te nemen z o n d e r t e i n j e c t e r e n en
de gevoeligheid w o r d t b e p a a l d door een
calibratiecurve op te nemen.
Het bepalen van m en S kan op de v o l gende manier gebeuren:
b
•
Neem
een
chromatogram
op,
op
de
meest gevoelige stand van de detect o r , e n b e p a a l h i e r u i t S e n Np_ m e t
behulp van Vergelijking 14;
• Neem een calibratiecurve op waarin
het
piekoppervlak
wordt
uitgezet
tegen de c o n c e n t r a t i e en b e p a a l uit
de helling van deze curve m.
b
De bepalingsgrens kan
wijze worden bepaald:
op
p
soortgelijke
r
1 %
4
1 %
] %
l c m
Niet de laagste concentratie die g e meten kan worden, maar
de bepalingsgrens en de d e t e c t i e g r e n s zijn belangrijk.
De b e p a l i n q s q r e n s (Limit of q u a n t i t a tion - LOQ) en de d e t e c t i e g r e n s
(Limit
of d e t e c t i o n - L O D ) w o r d e n v o l g e n s
de
IUPAC d e f i n i t i e g e r e l a t e e r d aan de stand a a r d d e v i a t i e v a n d e b l a n c o (S ) e n d e
*v h e l l i n g v a n d e c a l i b r a t i e c u r v e (m) z o a l s
w e e r g e g e v e n in v e r g e l i j k i n g 1 3 :
b
Bij
chromatografische
bepalingen
is
het
moeilijk
om
een
blancowaarde
te
verkrijgen en moet S met behulp van een
andere m e t h o d e w o r d e n b e p a a l d . Dit kan
door S te d e f i n i ë r e n als een v i j f d e van
de p i e k - p i e k r u i s (Np_ ) g e m e t e n o v e r d e
laatste 20 'meetpunten':
L O Q = 10 x S
b
/ m
(15)
Na het b e r e k e n e n v a n d e L O D en
LOQ
moet g e c o n t r o l e e r d w o r d e n of de g e v o n d e n
waarden wel realistisch
zijn. Dit
kan
gebeuren door een stamoplossing van de
te analyseren
verbinding
te
verdunnen
tot h e t c o n c e n t r a t i e n i v e a u v a n d e L O D e n
deze oplossing vervolgens te
chromatograferen.
Hetzelfde
kan
gedaan
worden
bij het c o n t r o l e r e n v a n d e L O Q . B e l a n g r i j k is h i e r b i j d a t e e n t o t o p h e t L O Q
niveau verdunde oplossing minimaal
zes
maal wordt geïnjecteerd en dat de variat i e c o e f f i c i e n t (CV) w o r d t b e r e k e n d . A l s
vuistregel wordt v a a k a a n g e h o u d e n dat op
het L O Q n i v e a u d e C V n i e t
groter
mag
zijn dan 2 0 % .
Literatuur:
Een
uitgebreide
discussie
omtrent
methoden
om bepalingsen
detectiegrenzen
te bepalen
kan gevonden
worden
in:
J.E.
Knoll,
Estimation
of the Limit
of
Detection
in
Chromatography,
J.
Chromatogr.
Sci.,
23 (1985)
422.
J.P. Foley
and J.G. Dorsey,
Clarification of the Limit
of Detection
in
Chromatography,
Chromatographia,
18
(1984)
503.
2.3.2
Kwaliteitsaspecten
b
b
p
S
b
= N„
/ 5
De ruis wordt
(14)
bepaald
door
een
chromato-
Tenslotte
zullen
enkele
kwaliteitsaspecten
worden
besproken.
Ieder
laboratorium zal e c h t e r v o o r zich m o e t e n
uitmaken w e l k e k w a l i t e i t s s t a n d a a r d e n er
gehanteerd
zullen
gaan
worden.
In
de
meeste
laboratoria
gelden
de
volgende
regels met b e t r e k k i n g tot L C :
•
•
•
•
•
•
Alle
instrumenten moeten
logboeken
hebben en er moeten SOP's aanwezig
zijn m e t h i e r i n een u i t g e b r e i d e omschrijving hoe deze gebruikt dienen
te worden;
Alle
instrumenten
moeten
gecalibreerd
zijn volgens
schriftelijk
vastgelegde procedures en de resultaten moeten
hiervan
worden
vastgelegd;
Alle reagentia moeten gelabeld word e n o p h e t m o m e n t d a t ze b i n n e n k o men
en
er
moet
worden
aangegeven
w a n n e e r ze g e o p e n d w o r d e n ;
Alle
eluenscontainers
moeten
duidelijk v e r m e l d e n wat de inhoud is,
de datum w a a r o p het eluens
bereid
is e n t o t w a n n e e r h e t g e b r u i k t m a g
w o r d e n . O p het laboratorium
moeten
centraal
de
batchnummers
worden
bijgehouden
van
de
gebruikte
reagentia;
Het e l u e n s dat uit de detector komt
m o e t v e r z a m e l d w o r d e n in g o e d g e l a b e l d e a f v a l v a t e n en zeker niet
in
lege 'Winchesters';
Al het onderhoud aan de apparatuur
moet nauwkeurig worden bijgehouden.