Transcript Kwantitatieve cytomegalovirus

 PAGE 1
Ref.: Dia-CMVQ-050.Vs1
03.10.14
Kwantitatieve cytomegalovirus
real-time PCR
Gebruiksaanwijzing
Beschikbaar op:
• ABI® 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT-StepOnePlus™
• Roche LightCycler® 480 / Lc2.0
• Biorad iCycler® / IQ5 / CFX96
• Qiagen Rotor-Gene® 6000
• Agilent Stratagene® MX3000P / 3005P
In combinatie met:
• Universele inhibitie controle, Ref.:
DIA-UIC(YD)-050
(inclusief)
• DNA extractie & PCR inhibitie controle, Ref.:
DIA-EIC/DNA(YD)-050
DIA-EIC/DNA(DR)-050
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050
0120
www.diagenodediagnostics.com
PAGE 2
DIAGENODE QUANTITATIVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
Inhoud
Algemene informatie.......................................................................................................................
Beoogd gebruik...............................................................................................................................
Informatie over het pathogeen........................................................................................................
Product beschrijving........................................................................................................................
Opslag.............................................................................................................................................
Waarschuwingen en Voorzorgsmaatregelen..................................................................................
Benodigdheden (Niet meegeleverd)...............................................................................................
Gebruikt menselijke materiaal / Toepassingsgebied van de kit......................................................
4
4
4
5
6
6
7
8
Materiaal afname, opslag en transport...........................................................................................
1. Materiaal afname....................................................................................................................
2. Materiaal opslag......................................................................................................................
3. Materiaal transport..................................................................................................................
8
8
8
8
Protocol...........................................................................................................................................
A. Te volgen procedure
A.1. Extractie procedure (zie punt II. Materiaal extractie / DNA isolatie)....................................
A.2. PCR procedure (zie punt III. PCR reactie instellen)............................................................
A.3. Amplificatie en real-time systeem procedures.....................................................................
A.4. Interpretatie van resultaten..................................................................................................
B. Bijlagen van de procedure
B.1. DNA extractie en inhibitie controle (optioneel).....................................................................
B.2. Materiaal extractie/DNA isolatie.........................................................................................
B.3. PCR reactie instellen ..........................................................................................................
B.4. PCR profiel .........................................................................................................................
B.5. Selectie van de geschikte kleurstoffen ...............................................................................
ABI 7000-7300-7500-7900HT / StepOnePlus™ ....................................................................
Roche Lc480 - Lc2.0...............................................................................................................
Biorad iCycler-IQ5-CFX96 …..................................................................................................
Agilent Stratagene MX3000P-3005P .....................................................................................
Qiagen Rotor-Gene 6000 .......................................................................................................
B.6. Interpretatie van resultaten .................................................................................................
Handleiding problemen oplossen ...................................................................................................
Evaluatie van de kit...............................................................................................................
Analytische gevoeligheid ............................................................................................................
Specificiteit .................................................................................................................................
Evaluatie van de diagnose .........................................................................................................
Beperkingen betreffende het gebruik van het product ...................................................................
Kwaliteit controle ............................................................................................................................
Referenties .....................................................................................................................................
Verklaring van symbolen ................................................................................................................
9
9
9
10
11
14
15
16
20
20
20
21
21
21
22
23
24
25
25
25
26
27
27
27
28
Mededeling aan koper....................................................................................................................
29
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 4
DIAGENODE KWANTITATIVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Algemene informatie
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit van Diagenode is een in vitro
diagnostische assay die wordt gebruikt door klinische laboratoria en door geschoolde laboranten.
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit van Diagenode is gevalideerd
voor:
•ABI® (7000 / 7300 / 7500 /7900HT / StepOnePlus™)
•Roche® (Lc480 / Lc2.0)
•Biorad® (iCycler / IQ5 / CFX96)
•Qiagen Rotor-Gene® (3000 / 6000)
•Agilent Stratagene® (MX3000P / 3005P)
Beoogd gebruik
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit van Diagenode is een in vitro diagnostische
kit die wordt gebruikt om het menselijke cytomegalovirus (CMV) op te sporen in totaal
bloed/EDTA of plasma/citraat.
De kit wordt gebruikt voor potentieel met het cytomegalovirus besmette materialen.
Deze IVD assay wordt gebruikt in diagnostiek laboratoria door gekwalificeerde laboranten. Met
deze kit kan een kwantitatieve real-time PCR worden ingezet voor de detectie en kwantificatie
van viraal CMV. De kit bevat: een standaard kwantificatie curve, een positieve en negatieve
controle en een PCR inhibitie controle. Optioneel kan de kit gecombineerd worden met een DNA
extractie controle.
Informatie over het pathogeen
Het cytomegalovirus, een DNA-virus met enveloppe, behoort tot de familie van de
herpesvirussen. Andere herpesvirussen veroorzaken waterpokken, besmettelijke mononucleose,
koortsuitslag en genitale herpes. Deze virussen kunnen levenslang in het lichaam van de
gastheer blijven sluimeren.
Het CMV verspreidt zich in de lichaamsvloeistoffen van de besmette persoon en kan worden
aangetoond in onder andere urine, speeksel, totaal bloed/EDTA, tranen, sperma en moedermelk.
Een CMV-infectie is ernstig bij sommige hoge risicogroepen zoals foetussen tijdens de
zwangerschap, personen die met kinderen werken en personen met een verzwakt
immuunsysteem zoals ontvangers van een orgaan transplantaat of personen besmet met het
humane immunodeficiëntievirus (HIV).
Europe Diagenode
sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 5
Product beschrijving
Het product bevat primers, probes, een kwantitatieve curve (5 verdunningen) en een positieve
en negatieve controle. De master mix is niet meegeleverd. Kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit: 50 PCR's (PCR volume 50 μl), 2 zakjes.
I. Primers/probes en zakje met kwantitatieve curve:
1. CMV dubbele kleurstof probe & primers (FAM, 520 nm): 500 μl, rood buisje.
2. Inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers (gele kleurstof, 548 nm):
500 μl, hemelsblauw buisje.
3. Plasmide inhibitie controle: 250 μl, grijs buisje.
4. CMV curve, 400000 kopieën/μl: 25 μl, geel buisje (kwantitatieve curve).
5. CMV curve, 40000 kopieën/μl: 25 μl, geel buisje (kwantitatieve curve).
6. CMV curve, 4000 kopieën/μl: 25 μl, geel buisje (kwantitatieve curve).
7. CMV curve, 400 kopieën/μl: 25 μl, geel buisje (kwantitatieve curve).
8. CMV curve, 40 kopieën/μl: 25 μl, geel buisje (kwantitatieve curve).
9. H2O (Rnase/Dnase-vrij): 1000 μl, donkerblauw buisje.
10. Negatieve CMV controle: H2O (Rnase/Dnase-vrij): 500 μl, paars buisje.
II. Zakje met positieve controle:
1.CMV positieve controle: 500 μl, groen buisje
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit (DIA-CMVQ-050) wordt gebruikt in
combinatie met de DNA extractie & PCR inhibitie controle (DIA-EIC/DNA-050). DNA extractie & PCR inhibitie controle real-time PCR: 50 PCR's (PCR volume 50 μl), 1 zakje.
I. (DNA virus) primers & dubbele kleurstof probe:
1. Voor de gele kleurstof (DIA-EIC/DNA(YD)-050), emissie 548 nm: 250 μl, groen buisje.
2. Voor de oranje kleurstof (DIA-EIC/DNA(DR)-050), emissie 575 nm: 250 μl, blauw buisje.
3. Voor Cy5 (DIA-EIC/DNA(Cy5)-050), emissie 662 nm: 250 μl, donkerblauw buisje.
II. DNA viruskweek: 1000 μl, geel buisje.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 6
DIAGENODE KWANTITATIVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Opslag
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit dient tot de houdbaarheidsdatum bij -20 °C
worden bewaard.
NB:
Als u de DIA-EIC/DNA-050 gebruikt, dan moeten de kit en de DNA viruskweek bij -20 °C
worden bewaard. Controleer de houdbaarheidsdata die vermeldt staan op de etiketten van het
zakje en de buisjes.
Geopende kits zijn voor 12 maanden bruikbaar als ze worden opgeslagen op een donkere plek
bij 4 °C.
NB:
Fractioneer de oplossingen om vries-dooi cycli zoveel mogelijk te vermijden. Hanteer alle
onderdelen van de kit bij 4 °C.
BEWAAR OP EEN DONKERE PLEK
Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen
Neem contact met ons op indien u een beschadigde of ontdooide kit ontvangt.
[email protected] / +32 4 364 20 52
Algemene aanbevelingen
 Lees alle instructies alvorens de test uit te voeren.

Na gebruik moeten de gebruikte reagentia worden behandeld als potentieel besmet en
worden weggegooid in een specifiek voor biologisch materiaal bedoelde afvalbak.

Verwissel reagentia uit de kit niet met andere batchnummers of met die van andere
fabrikanten.
Extractie/PCR
 De real-time PCR kits van Diagenode mogen enkel gebruikt worden door laboranten
met een grondige kennis van moleculaire biologie en in het bijzonder van real-time
PCR.

Voor optimale resultaten raadt Diagenode enkele aangepaste extractie methoden aan
om zo PCR inhibitoren te voorkomen (zie punt B.2. Materiaal extractie /DNA isolatie).

Voor elke PCR reactie moet de extractie en/of inhibitie controle worden gebruikt.

Met het oog op een verdere diagnose van een patiënt: het wordt laboranten aanbevolen
om hiervoor dezelfde extractie methode, dezelfde kit leverancier, dezelfde master mix
en hetzelfde real-time PCR systeem te gebruiken.
Opgelet
Diagenode verkoopt een kwalitatieve extractie en/of inhibitie controle. Indien de resultaten voor
de inhibitie en/of extractie controle niet bevredigend zijn, is het aan de gebruiker om de extractie
procedure te optimaliseren om een gewenst resultaat te verkrijgen.

Virussen die dienen ter controle, moeten worden gehanteerd in een veiligheidskabinet voor
een handmatige extractie procedure of in een specifieke ruimte voor een automatische
extractie procedure, zoals voorgesteld door de fabrikant.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 7
Besmetting

Het openen, isoleren en real-time amplificeren van nucleïnezuur moeten worden
uitgevoerd in gescheiden laboratorium ruimten.

Houd alle buisjes en flacons gesloten als deze niet worden gebruikt.

Het PCR laboratorium (veiligheidskabinet, DNA/RNA extractie locatie, werkblad, etc.)
moet na elk PCR experiment worden schoongemaakt met de juiste oplossingen.

De besmette kits moeten worden weggegooid in een specifiek voor biologisch materiaal
bedoelde afvalbak.

De kit mag niet worden gebruikt door iemand die symptomen vertoont van de ziekte die
met behulp van de kit wordt gedetecteerd.

De positieve en negatieve PCR controle moet worden uitgevoerd bij elke PCR reactie.

Het dragen van handschoenen is verplicht.

Aerosol resistant filtertips moeten worden gebruikt voor alle pipetteer handelingen.

Vóór opening moeten de buisjes worden gecentrifugeerd.

Pipetteer de oplossingen nooit met de mond. Rook, eet of drink niet in de ruimtes waar
materiaal of reagentia van de kit worden gehanteerd.

Voorkom inname van onderdelen uit de kit.

De tests mogen niet door zwangere vrouwen worden uitgevoerd vanwege potentiële
risico's voor de foetus.
Opgelet
Het bewaren van de kit op kamertemperatuur kan leiden tot de degradatie van de
primers, probes, positieve controle en/of plasmiden. Dit leidt tot een verlaagde
gevoeligheid en het gebruik van een nieuwe kit is dan ook aanbevolen.
Benodigdheden (Niet meegeleverd)

Pipetten

Steriele filtertips met filter (Rnase/Dnase-vrij)

Poedervrije handschoenen

Vortex

Tafel centrifuge

Rnase/Dnase-vrije microcentrifuge buisjes (1,5 en/of 2 ml)

PCR 96-well plate

Schort

Rnase/Dnase-vrij water

DNA isolatie kit (zie punt B.2. Materiaal extractie/DNA isolatie)

Verbruiksmaterialen en toebehoren (buisjes, microcentrifuge, reactie platen, afplakstrip)
voor ABI / Roche / Biorad / Qiagen / Agilent Stratagene systeem

Master mix (zie punt B.3. PCR reactie instellen)

Real-time PCR apparaat: ABI / Roche / Biorad / Qiagen of Agilent Stratagene

Laminaire flowkast (Mix/DNA)
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 8
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Gebruikt menselijke materiaal /
Toepassingsgebied van de kit
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit wordt gebruikt voor het op sporen en het
kwantificeren van het cytomegalovirus (alle stammen) in totaal bloed/EDTA of plasma/citraat.
De kit wordt gebruikt voor materiaal van patiënten die potentieel met het cytomegalovirus zijn
besmet. Materiaal afname, opslag en transport
1. Materiaal afname
Menselijk bloed als materiaal zoals totaal bloed/EDTA en/of plasma/citraat.
2. Materiaal opslag
Menselijke materiaal moet worden bewaard bij 4 °C voor maximaal 24 uur.
Menselijke materiaal moet worden opgeslagen in Rnase/Dnase-vrije polypropylene
buisjes. De gevoeligheid van de PCR kan afnemen wanneer menselijke materiaal
herhaaldelijk wordt ingevroren en ontdooid. Vermijd vries-dooi cycli, deze tasten de
gevoeligheid van het assay aan.
3. Materiaal transport
Materiaal van menselijk totaal bloed/EDTA en/of plasma/citraat moet in aangepaste
containers worden vervoerd.
Het materiaal moet worden vervoerd in overeenstemming met de lokale en nationale
voorschriften voor het transport van pathogeen materiaal.
Voor transporten langer dan 24 uur wordt een transport bij -20 °C geadviseerd om de
afbraak van DNA te voorkomen.
Primers en probes kunnen binnen het laboratorium bij kamertemperatuur worden vervoerd.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 9
Protocol
A. Te volgen procedures
A.1. Extractie procedure (zie punt B.2. Materiaal extractie / DNA isolatie) .
Voer deze procedure uit in de faciliteit met het geschikte biosafety level.
Volg de volgende stappen:

Breng het materiaal op kamertemperatuur

Kies de voor uw materiaal geschikte extractie methode (zie punt B.2. voor de door
Diagenode gevalideerde protocollen).

Volg de instructie van de fabrikant tijdens de extractie.
(Optioneel) Voeg bij gebruik van de DNA extractie & PCR inhibitie controle, 10 μl van de
Diagenode DNA extractie & inhibitie controle (DNA viruskweek buisje) toe aan het geëxtraheerde
volume (zie punt B.1. DNA extractie en inhibitie controle en B.2. Materiaal extractie//DNA
isolatie).
NB:
De DNA extractie & inhibitie controle van Diagenode wordt afzonderlijk geleverd, Ref.: DIAEIC/DNA-50.
U kunt de aan uw real-time PCR systeem aangepaste kleurstof kiezen (zie punt B.5. Selectie
van de geschikte kleurstoffen).

Na het voltooien van de extractie procedure, moet het DNA voorafgaand aan gebruik op
een temperatuur van 4 °C worden gebracht (of op -20 °C voor lange opslag, meer dan 24
uur).

Plaats het CMV positieve controle buisje en de vijf CMV DNA kwantitatieve curve buisjes
bij 4 °C.
NB:
Het geëxtraheerde DNA kan op kamertemperatuur maximaal 2 uur worden bewaard. Langere
bewaartijden kunnen leiden tot de afbraak van het materiaal. Wanneer het DNA afgebroken is,
zal de gevoeligheid van de PCR verminderen! Indien het CMV positieve controle buisje en/of de
vijf CMV DNA kwantitatieve curve buisjes langdurig op kamertemperatuur blijven (> 24 uur),
kunnen de plasmiden (positieve controle & kwantitatieve curve) zijn afgebroken en de verkregen
resultaten beïnvloeden!
A.2. PCR procedure
(zie punt B.3. PCR reactie instellen)
Voer deze procedure uit in de faciliteit met het geschikte biosafety level.
Aanbevolen master mix: QuantifastTM Probe PCR + ROX vail kit, Qiagen (niet meegeleverd) (zie
punt B.3. PCR reactie instellen)
NB:
Wij adviseren:
‐ Rotor-Gene Multiplex PCR Kit (Qiagen) (niet meegeleverd) voor Qiagen Rotor-Gene
‐ LightCycler® TaqMan® Master (Roche) (niet meegeleverd) voor LightCycler 2.0 (Lc2.0)
Volg de volgende stappen:

Breng de kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit op kamertemperatuur: het rode
buisje (Cytomegalovirus primers & dubbele kleurstof probe), het hemelsblauwe buisje
(interne controle primers en dubbele kleurstof probe), het donkerblauwe buisje (H2O
Rnase/Dnase-vrij) van de primers/probes en de kwantitatieve curve.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 10
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING

(Optioneel) Breng bij gebruik van de DNA extractie & PCR inhibitie controle real-time
PCR het buisje met de primers & dubbele kleurstof probes op kamertemperatuur (in
plaats van het hemelsblauwe buisje, interne controle primers en dubbele kleurstof
probe)

Plaats de master mix bij 4 °C.
NB:
Centrifugeer ontdooide oplossingen kortstondig en homogeniseer ze met behulp van een
pipet.

Kies het geschikte protocol afhankelijk van het gebruikte real-time PCR systeem (zie
punt B.3. PCR reactie instellen) en bereid mengsels zonder het materiaal en/of de
positieve controle en/of de kwantitatieve curve.
NB:
Bereid twee verschillende mengsels (zie punt B.3. PCR reactie instellen):
1) De kwalitatieve PCR
2) De kwantitatieve curve
Belangrijke opmerking:
Om de test te valideren, moet u een negatieve controle (H2O Rnase/Dnase-vrij) uitvoeren en
een positieve controle van Diagenode uitvoeren.

Pipetteer de bereide mixen in de geschikte buisjes of in de 96-well plate.

Voeg het materiaal, de Diagenode positieve controle (hetzelfde volume als het
materiaal) en de vijf CMV DNA verdunningen van de kwantitatieve curve toe.

Sluit de buisjes of de plaat.
NB:
Bij het niet gebruiken van de Universal inhibitie controle en/of de PCR DNA extractie &
inhibitie controle (DIA-EIC/DNA-050), dienen de controles vervangen te worden door
Rnase/Dnase-vrij water.
A.3. Amplificatie en real-time systeem procedures
(zie punt B.4. PCR profiel en B.5. Selectie van de geschikte kleurstoffen)
Diagenode ontwerpt en valideert kits die aangepast zijn aan de volgende real-time PCR
systemen: ABI / Roche / Biorad / Qiagen / Agilent Stratagene.
Volg de instructies van de fabrikant vóór gebruik te maken van de real-time apparaten.
Volg de volgende stappen:

Plaats de gesloten buisjes of de 96-well plate in het real-time systeem.

Kies het PCR profiel (zie punt B.4. PCR profiel).

Kies de voor het real-time systeem geschikte kleurstoffen (zie punt B.5. Selectie van
de geschikte kleurstoffen)

Voer de naam en de plaats van het materiaal in in de software.

Start de test.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 11
A.4 Interpretatie van resultaten
(Zie punt B.6. Interpretatie van resultaten)
Volg de instructies van de fabrikant om de resultaten te analyseren.
Volg de volgende stappen:
A.4.1. Kwalitatieve PCR:

Bekijk de FAM detector (cytomegalovirus) en de gele kleurstof detector (of oranje
kleurstof/Cy5 bij gebruik van andere kleurstoffen) (interne controle) afzonderlijk (zie punt
B.6. Interpretatie van resultaten):
- Negatieve controle: het FAM signaal mag niet verschijnen.
- Positieve controle: het FAM signaal moet verschijnen, Ct/Cp waarde 23.0 ± 3.3
(afhankelijk van het gebruikte real-time systeem).
- Voor onbekende materialen:

Wanneer het FAM signaal verschijnt, is het materiaal positief voor het
cytomegalovirus.

Wanneer het FAM signaal niet verschijnt, is het materiaal negatief voor het
cytomegalovirus.
Bij afwezigheid van FAM signaal :

Een signaal van de Gele Kleurstof (of Oranje Kleurstof/Cy5) boven de drempelwaarde,
27 ≤ Ct/Cp waarde ≤ 36, moet als positief worden beschouwd voor de inhibitie controle.
De test is geldig.

Een signaal van de Gele Kleurstof (of Oranje Kleurstof/Cy5) onder de drempelwaarde
moet als negatief worden beschouwd voor de inhibitie controle. Het test is ongeldig,
herstart de DNA extractie procedure en/of de PCR procedure.
NB:
Indien de Ct/Cp waarde van de inhibitie controle (of de DNA extractie & inhibitie controle real-time
PCR) ≥ 36:

Raden we in de eerste plaats aan om een PCR uit te voeren met een 10x verdund
materiaal om op deze manier het aantal inhibitoren te minimaliseren.

Indien het probleem aanhoudt, raden we aan om de extractie procedure opnieuw te doen
en/of te zoeken naar een andere meer geschikte nucleïnezuur extractie procedure.

Kies het verslag document voor een samenvatting van Ct/Cp resultaten en curves.
A.4.2. Kwantitatieve curve:
Het FAM signaal moet worden waargenomen bij de 5 CMV DNA verdunningen van de
kwantitatieve curve.
Label van buisje
CMV curve 400.000 kopieën/μl
CMV curve 40.000 kopieën/μl
CMV curve 4.000 kopieën/μl
CMV curve 400 kopieën/μl
CMV curve 40 kopieën/μl
Kopieën van CMV amplicon / PCR reactie
1.000.000 kopieën/PCR reactie
100.000 kopieën/PCR reactie
10.000 kopieën/PCR reactie
1.000 kopieën/PCR reactie
100 kopieën/PCR reactie
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 12
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Inter-assay variatie van standaarden
Om de DIA-CMVQ-050 standaard curve te valideren, wordt de standaard curve geprepareerd
en wordt de PCR uitgevoerd volgens de bijsluiter van de kit, met de Qiagen QuantifastTM
Probe PCR Master mix.
De 5 samples van de standaard curve werden getest in 10 replica’s en het experiment werd
drie keer herhaald door drie verschillende laboranten. Bovendien werden 2 verschillende
apparaten gebruik om de inter-assay variaties te bepalen.
De onderstaande tabellen tonen de verkregen resultaten en verwachte waarden voor de
verschillende punten van de kalibratie curve met een 95% betrouwbaarheidsinterval.
PCR apparaat: Lc480 (Roche)
Standaard
QS 1 (106 k/pcr)
QS 2 (105 k/pcr)
QS 3 (104 k/pcr)
QS 4 (103 k/pcr)
QS 5 (102 k/pcr)
Gemiddelde Ct
20,37
23,57
25,81
29,15
31,98
SD
1,40
1,11
0,80
0,83
0,92
SE
0,81
0,64
0,46
0,48
0,53
CV (%)
6,89
4,70
3,08
2,84
2,87
Ct bereik (95% BI)
18,79 tot 21,97
22,32 tot 24,83
24,91 tot 26,71
28,22 tot 30,10
30,95 tot 33,02
De statistische resultaten zijn verkregen volgens een handnatige nullijn drempelwaarde:
Absolute kwantificatie - “Fit Points”.
PCR apparaat: CFX96 (BioRad)
Standaard
QS 1 (106 k/pcr)
QS 2 (105 k/pcr)
QS 3 (104 k/pcr)
QS 4 (103 k/pcr)
QS 5 (102 k/pcr)
Gemiddelde Ct
20,33
22,82
26,40
29,46
32,76
SD
0,90
1,17
0,49
0,07
0,26
SE
0,52
0,67
0,28
0,04
0,15
CV (%)
4,42
5,12
1,85
0,24
0,79
Ct bereik (95% BI)
19,32 tot 21,35
21,50 tot 24,14
25,85 tot 26,96
29,38 tot 29,55
32,47 tot 33,06
De statistische resultaten zijn verkregen volgens een geautomatiseerde
drempelwaarde: Auto-calculated (instellingen: baseline substracted curve fit)
nullijn
De verkregen Ct/Cp waarden moeten evenredig zijn met de CMV DNA verdunningen:

ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCyclerIQ5- CFX96 / Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene:
Om de DNA CMV kwantitatieve curve te valideren, moet de hellingswaarde worden
gecontroleerd die door het programma van het real-time PCR systeem is berekend.
De hellingswaarde moet zich bevinden tussen: -3,0 ≤ helling ≤ -3,6.
NB:
Als hellingswaarde < -3,0, herstart de bereiding van de CMV DNA kwantitatieve curve.
Als hellingswaarde > -3,6, herstart de bereiding van de CMV DNA kwantitatieve curve. 
Roche Lc480/Lc2.0:
Voor de validatie van de DNA CMV kwantitatieve curve, moet de Efficiëntiewaarde
worden gecontroleerd die door de software van het real-time PCR systeem is
berekend.
De Efficiëntiewaarde moet zich bevinden tussen: 1,9 ≤ Efficiëntiewaarde ≤ 2,1.
NB:
Bij Efficiëntiewaarde < 1,9 herstart de bereiding van de CMV DNA kwantitatieve curve.
Bij Efficiëntiewaarde > 2,1 herstart de bereiding van de CMV DNA kwantitatieve curve.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 13
NB:
Bij elke test moeten alle vijf de verdunningen van de kwantitatieve curve worden getest.
Wanneer aan alle voorwaarden van de kwantitatieve curve voldaan is, kunnen de
verkregen resultaten dienen om de samples te kwantificeren.
A.4.3. Bepaling van CMV virus kopieën/ml
Volume van de kwantitatieve curve: 2.5 µl van elke verdunning (5)
Gebruik de volgende waarden voor uw standaard curve:
Label van buisje
Kopieën van CMV amplicon / PCR reactie
CMV curve 400.000 kopieën/μl
CMV curve 40.000 kopieën/μl
CMV curve 4.000 kopieën/μl
CMV curve 400 kopieën/μl
CMV curve 40 kopieën/μl
1.000.000 kopieën/PCR reactie
100.000 kopieën/PCR reactie
10.000 kopieën/PCR reactie
1.000 kopieën/PCR reactie
100 kopieën/PCR reactie
 verkregen resultaat kopieën PCR reactie
elutie volume  l  
 1000  resultaat kopie ml  *


extractie volume  l  
 volume van geëxtraheerd sample  l 
* Aantal kopieën in 1 ml van het originele sample.
Volume van de kwantitatieve curve: 5 µl van elke verdunning (5)
Gebruik de volgende waarden voor uw standaard curve:
Label van buisje
Kopieën van CMV amplicon / PCR reactie
CMV curve 400.000 kopieën/μl
CMV curve 40.000 kopieën/μl
CMV curve 4.000 kopieën/μl
CMV curve 400 kopieën/μl
CMV curve 40 kopieën/μl
2.000.000 kopieën/PCR reactie
200.000 kopieën/PCR reactie
20.000 kopieën/PCR reactie
2.000 kopieën/PCR reactie
200 kopieën/PCR reactie
 verkregen resultaat kopieën PCR reactie
elutie volume  l  
 1000  resultaat kopie ml  *


extractie volume  l  
 volume van geëxtraheerd sample  l 
* Aantal kopieën in 1 ml van het originele sample.
Elutie volume: Sample volume na de extractie (ex: 60 µl)
Extractie volume: sample volume voor de extractie (ex: 200 µl)
Volume van geëxtraheerd sample: sample volume voor de PCR (ex: 5 µl)
NB:
Met het oog op een verdere diagnose van een patiënt:

Het wordt laboranten aanbevolen om hiervoor dezelfde extractie methode, dezelfde kit
leverancier, dezelfde master mix en hetzelfde real-time PCR systeem te gebruiken.
 We raden aan om alleen de kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit van
Diagenode te gebruiken.
Om de virus status van de patiënt te bepalen, is het ten stelligste aangeraden om de
resultaten van de kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR kit te vergelijken met
andere diagnostische onderzoeksmethoden.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 14
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
A.4.4. Bepaling van de conversie coëfficiënt voor het omzetten van de kwantitatieve
resultaten (CMV kopieën/ml) naar international eenheden (IU/ml).
Voor deze studie worden de resultaten die verkregen zijn uit de twee kwantitatieve standaard
curven vergeleken: de eerste curve is verkregen met een Diagenode kit voor het detecteren
van het cytomegalovirus (DIA-CMVQ-050) en de tweede curve is verkregen met behulp van
een internationale standaard voor het menselijk cytomegalovirus (NIBSC code 09/162).
Op grond van de resultaten van deze studie concluderen wij dat de conversie coëfficiënten
perfect consistent zijn met de volgende PCR volumes: 25 μl en 50 μl.
Dus één kopie plasmide/ml is gelijk aan 1,2 IU/mL.
B. Bijlagen van de procedure
B.1. DNA extractie & inhibitie controle (optioneel)
De DNA extractie & inhibitie controle van Diagenode is een viruskweek met een virale lading
van 1.000 TCID50/ml.
De universele DNA extractie & inhibitie controle is een volledig virus dat
besmettelijk is. Dit virus is ingedeeld in de klasse Ea1*, opgesteld door de EFB
(European Federation of Biotechnologies).
Dit virus wordt als ongevaarlijk beschouwd voor de mens, maar moet worden
gehanteerd in een veiligheidskabinet.
* (meer details achter in deze handleiding).
Procedure:

10 μl van elke verdunning
geëxtraheerd in 500 μl water.

Nuclisens easyMAG® system
(extractie "on board").

Elutie in 60 μl.

5 μl gebruikt voor de PCR.

TaqMan® Universal PCR master
mix (Applied Biosystems).

De testen zijn uitgevoerd op het ABI
Prism® 7000 apparaat (Applied
Biosystems).
De Ct waarde voor 1.000 TCID50/ml is ±28,5. De bovenstaande figuur toont ook de resultaten
van andere verdunningen (100 TCID50/ml tot ±31,5 en 10 TCID50/ml tot ±35,0).
Voor de extractie/DNA isolatie, dient net voor de start van deze procedure, 10 μl van de
IC DNA viruskweek toe te worden gevoegd aan het sample.
(De concentratie kan worden aangepast om de multiplex PCR aan te passen aan de
gebruikte extractie methode).
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 15
B.2. Materiaal extractie/DNA isolatie
Diagenode raadt drie extractie methoden aan:

Nuclisens EASYMAG® Systeem (Biomerieux)
Klinisch materiaal: plasma/citraat.
Volg de instructies van de fabrikant:
Geëxtraheerd volume menselijk plasma/citraat: 200 μl
(+10 μl van de DIA-EIC/DNA-050 wanneer gebruik wordt gemaakt van de DNA
extractie & PCR inhibitie controle real-time PCR)
Volume geïsoleerd DNA: 60 μl (elutie volume)

QIAamp DNA Mini kit (50) (Blood and Body Fluid Spin Protocol)
(Qiagen Ref.: 51304)
Klinisch materiaal: totaal bloed/EDTA, plasma/citraat
Volg de instructies van de fabrikant:
Geëxtraheerd volume menselijk plasma/citraat: 200 μl
(+10 μl van de DIA-EIC/DNA-050 wanneer gebruik wordt gemaakt van de DNA
extractie & PCR inhibitie controle real-time PCR)
Volume geïsoleerd DNA: 60 μl (elutie volume)

Maxwell 16 Blood DNA Purification kit (48) (Promega Ref.: AS1010)
Klinisch materiaal: totaal bloed/EDTA, plasma/citraat
Volg de instructies van de fabrikant:
Geëxtraheerd volume menselijk plasma/citraat: 400 μl
(+10 μl van de DIA-EIC/DNA-050 wanneer gebruik wordt gemaakt van de DNA
extractie & PCR inhibitie controle real-time PCR)
Volume geïsoleerd DNA: 300 μl (elutie volume)
Algemene informatie over de extractie:
Wanneer de PCR op dezelfde dag wordt uitgevoerd kan het geëxtraheerde DNA worden
opgeslagen bij 4 °C, anders moet het bij -20 °C worden bewaard.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 16
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
B.3. PCR reactie instellen
(ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCycler-IQ5CFX96 / Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene)
Met de Quantifast Multiplex PCR + R kit (rox), Qiagen (niet meegeleverd) (Ref.: 204754)
NB:
Voor de Qiagen Rotor-Gene bevelen we de Rotor-Gene Multiplex PCR kit aan, Qiagen (niet
meegeleverd) (Ref.: 204774)
Voor de LightCycler 2.0 (Lc2.0) adviseren we de LightCycler® TaqMan® Master, Roche (niet
meegeleverd) (Ref.: 04535286001)

PCR 50 μl
(ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480 / Biorad iCycler-IQ5 /
Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene)
NB:
Voor de Qiagen Rotor-Gene adviseren we de Rotor-Gene Multiplex PCR kit, Qiagen
(niet meegeleverd) (Ref.: 204774)
Kwalitatieve PCR
25 μl………….....................2x master mix
5 μl……..............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
5 μl..................................... Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
10 μl……………................. Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
2,5 μl……………................ Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
50 μl................................... Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd.
Neem 1,5 μl Rnase/Dnase-vrij water.
Kwantitatieve curve
25 μl………….....................2x master mix
5 μl……..............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
5 μl..................................... Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
2,5 μl…………....................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400 of
40 kopieën/µl
10 μl….…………................ Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
50 μl................................... Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd.
Neem 9 μl Rnase/Dnase-vrij water.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 17

PCR 25 μl
(ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCycler-IQ5CFX 96 / Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene)
Kwalitatieve PCR
12,5 μl….…….....................2x master mix
2,5 μl…...............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl.................................. Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
5 μl…..…………................. Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
25 μl................................... Eindvolume
Kwantitatieve curve
12,5 μl………......................2x master mix
2,5 μl…...............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl.................................. Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
2,5 μl…………....................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400
of 40 kopieën/µl
2,5 μl….………................. Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
25 μl.,................................. Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 0,5 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd.
Neem 2 μl Rnase/Dnase-vrij water.

PCR 20 μl
(Roche Lc2.0)
Voor de LightCycler 2.0 (Lc2.0) adviseren we de LightCycler® TaqMan® Master, Roche
(niet meegeleverd) (Ref.: 04535286001).
Kwalitatieve PCR
4 μl……..…….....................5x master mix
2 μl…..................................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2 μl..................................... Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
5 μl…..…………................. Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
4,5 μl………………………..Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
20 μl................................... Eindvolume
Kwantitatieve curve
4 μl…......…….....................5x master mix
2 μl…..................................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2 μl..................................... Diagenode inhibitie controle dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl……………….............Diagenode inhibitie controle plasmide
2,5 μl…………....................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400 of
40 kopieën/µl
7 μl….......………................Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
20 μl................................... Eindvolume
Zie onderstaande protocollen bij gebruik van DIA-EIC/DNA-050, DNA extractie & PCR
inhibitie controle:
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 18
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING

PCR 50 μl
(ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480 / Biorad iCycler-IQ5 /
Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene)
NB:
Voor de Qiagen Rotor-Gene adviseren we de Rotor-Gene Multiplex PCR kit, Qiagen
(niet meegeleverd) (Ref.: 204774).
Kwalitatieve PCR
25 μl………….....................2x master mix
5 μl……..............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
5 μl..................................... Diagenode DNA extractie & PCR inhibitie controle dubbele kleurstof
probe & primers
10 μl……………................. Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
5 μl……………................... Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
50 μl................................... Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd.
Neem 4 μl Rnase/Dnase-vrij water.
Kwantitatieve curve
25 μl………….....................2x master mix
5 μl……..............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl…..….........................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400
of 40 kopieën/µl
17,5 μl……..……................Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
50 μl................................... Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd. Neem
16,5 μl Rnase/Dnase-vrij water.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 19

PCR 25 μl
(ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCycler-IQ5CFX 96 / Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene)
Kwalitatieve PCR
12,5 μl….…….....................2x master mix
2,5 μl…...............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl.................................. Diagenode DNA extractie & PCR inhibitie controle dubbele
kleurstof probe & primers
5 μl…...…………….............Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
2,5 μl…...……….................Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
25 μl................................... Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd. Neem
1,5 μl Rnase/Dnase-vrij water.
Kwantitatieve curve
12,5 μl………......................2x master mix
2,5 μl…...............................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl…………....................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400
of 40 kopieën/µl
7,5 μl….………...................Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
25 μl.,................................. Eindvolume
NB:
Met het ABI systeem kan 1 μl van de ROX oplossing (Qiagen) worden toegevoegd. Neem
6,5 μl Rnase/Dnase-vrij water.

PCR 20 μl
(Roche Lc2.0)
Voor de LightCycler 2.0 (Lc2.0) adviseren we de LightCycler® TaqMan® Master,
Roche (niet meegeleverd) (Ref.: 04535286001)
Kwalitatieve PCR
4 μl……..…….....................5x master mix
2 μl…..................................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2 μl..................................... Diagenode DNA extractie & PCR inhibitie controle dubbele kleurstof
probe & primers
5 μl…..…………................. Menselijk materiaal (of CMV positieve controle)
7 μl...………………………..Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
20 μl................................... Eindvolume
Kwantitatieve curve
4 μl…......…….....................5x master mix
2 μl…..................................Diagenode cytomegalovirus dubbele kleurstof probe & primers
2,5 μl…………....................Diagenode kwantitatieve curve: 400.000 of 40.000 of 4.000 of 400 of
40 kopieën/µl
11,5 μl…..………................Diagenode H2O (Rnase/Dnase-vrij)
20 μl................................... Eindvolume
Opgelet
Voor elke nieuwe PCR test moet een nieuwe mix worden bereid. Zowel de master mix
(niet meegeleverd) als de primers/probes van de kit moeten tijdens de gehele
voorbereiding van de PCR test op 4 °C blijven.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 20
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
B.4. PCR profiel

ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ / Roche Lc480 / Biorad iCycler-IQ5-CFX96
/ Agilent Stratagene MX3000P-3005P / Qiagen Rotor-Gene
Fase
1
Omschrijving
2 minuten bij 50 °C (1 cyclus)
2
3
10 minuten bij 95 °C (1 cyclus)
Cyclus programma (45 cycli)
Stap 1: 15 seconden bij 95 °C
Stap 2: 60 seconden bij 60 °C
NB:
Voor stap 2 van fase 3 is een vertraagde temperatuursverandering (°C/s) met 50% ten
stelligste aanbevolen.

Roche Lc2.0
Fase
Omschrijving
1
10 minuten bij 95 °C (1 cyclus)
2
Cyclus programma (45 cycli)
Stap 1: 10 seconden bij 95 °C
Stap 2: 40 seconden bij 60 °C
Stap 3: 1 seconde bij 72 °C
3
30 seconden bij 40 °C (1 cyclus)
B.5. Selectie van de geschikte kleurstoffen

ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™ Cytomegalovirus
Inhibitie controle (YD)
of
DIA-EIC/DNA(YD)-050
DIA-EIC/DNA(DR)-050
Diagenode detector
naam
FAM
Reporter
Quencher
FAM
(geen)
Gele kleurstof
Vic
(geen)
Oranje kleurstof
NED
(geen)
Cy5
Cy5
(geen)
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050*
Selecteer de passieve referentie: ROX (bij gebruik van master mix met ROX referentie)
Selecteer de passieve referentie: geen (bij gebruik van master mix zonder ROX referentie)
Inhibitie controle (YD) of DIA-EIC/DNA(YD)-050: ABI 7000 of 7300 of 7500 of 7900HT of
StepOnePlusTM
DIA-EIC/DNA(DR)-050: ABI 7000 of 7300 of 7500 of 7900HT of StepOnePlus™
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050: ABI 7500
* DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 kan worden vervangen door DIA-EIC/DNA(RD)-050
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]

PAGINA 21
Roche Lc480-Lc2 .0
Cytomegalovirus
Inhibitie controle (YD)
of
DIA-EIC/DNA(YD)-050
Diagenode detector
naam
FAM
Reporter
Quencher
FAM
(geen)
Gele kleurstof
Vic/Hex
(geen)
Cy5
Cy5
(geen)
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050*
Inhibitie controle (YD) of DIA-EIC/DNA(YD)-050: Lc2.0 of Lc480
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050: Lc480
* DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 kan worden vervangen door DIA-EIC/DNA(RD)-050
NB:
De eerste keer dat de real-time PCR kit wordt gebruikt op een Roche LightCycler 480 of 2.0,
dient er een kleurcompensatie ingesteld te worden voor Dia-DAF-050.

Biorad iCycler-IQ5-CFX96
Cytomegalovirus
Inhibitie controle (YD)
of
DIA-EIC/DNA(YD)-050
Diagenode detector
naam
FAM
Reporter
Quencher
FAM
(geen)
Gele kleurstof
Vic/Hex
(geen)
Cy5
Cy5
(geen)
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050*
* DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 kan worden vervangen door DIA-EIC/DNA(RD)-050

Agilent Stratagene MX3000P-3005P
Cytomegalovirus
Inhibitie controle (YD)
of
DIA-EIC/DNA(YD)-050
Diagenode detector
naam
FAM
Reporter
Quencher
FAM
(geen)
Gele kleurstof
Vic/Hex
(geen)
Cy5
Cy5
(geen)
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050*
* DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 kan worden vervangen door DIA-EIC/DNA(RD)-050
NB:
Bij Filter Set Gain Settings:

FAM: selecteer x8

Gele kleurstof: selecteer x2

Cy5: selecteer x4
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 22
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING

Qiagen Rotor-Gene 6000
Cytomegalovirus
Inhibitie controle
of
DIA-EIC/DNA(YD)-050
DIA-EIC/DNA(Cy5)-050*
Diagenode detector
naam
FAM
Kanaal
Gele kleurstof
Geel
Cy5
Rood
Groen
* DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 kan worden vervangen door DIA-EIC/DNA(RD)-050
NB:
Voer een optimalisatie uit bij 60 graden aan het begin van elke test voor het groene en rode
kanaal.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 23
B.6. Interpretatie van resultaten
Inhibitie controle
CMV
DIA-EIC/DNA-050
Signaal detectie
Gele kleurstof
FAM
Oranje kleurstof
Interpretatie van resultaten
Cy5
Signaal boven de
drempelwaarde
Signaal boven de
drempelwaarde
Het sample is positief voor
het cytomegalovirus
Signaal boven de
drempelwaarde
Signaal onder de
drempelwaarde
Het sample is positief voor
het cytomegalovirus
Signaal onder de
drempelwaarde
Signaal boven de
drempelwaarde
Het sample is negatief voor
het cytomegalovirus
Signaal onder de
drempelwaarde
Signaal onder de
drempelwaarde
Het sample is ongeldig. Zie
handleiding problemen
oplossen
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 24
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Handleiding problemen oplossen

Nucleïnezuur isolatie
Raadpleeg de product bijsluiter van de fabrikant.
NB:
Onderhoud de apparatuur voor geautomatiseerde extractie (volgens de richtlijnen van de
fabrikant). Controleer de houdbaarheidsdatum en opslag condities voor de meegeleverde
oplossingen.

PCR
Het gedetecteerde signaal voor de positieve cytomegalovirus controle, de
cytomegalovirus curve, de inhibitie controle (en/of DNA extractie & PCR inhibitie controle
voor real-time PCR) zijn negatief of zwak.
De PCR condities komen niet overeen met het protocol
1. Controleer de extractie procedure
Het is belangrijk om een geschikte extractie procedure te selecteren. De extractie
procedure moet gevalideerd zijn en de aanwezigheid van inhibitoren beperken.
2. Controleer het instellen van de PCR reactie
Om een hoge gevoeligheid te bereiken, moeten de voorgeschreven volumes en
de aanbevolen master mixen worden gebruikt.
NB:
Controleer de ijking van de gebruikte pipetten (volgens de richtlijnen van de fabrikant).
Controleer de houdbaarheidsdatum en opslag condities voor de master mixen.
3. Controleer het PCR profiel
Om een hoge gevoeligheid te bereiken moet het protocol worden gebruikt dat is
aangepast aan de gebruikte real-time PCR.
4. Controleer de geselecteerde kleurstoffen
Controleer en selecteer kleurstoffen die geschikt zijn voor het gebruikte real-time
PCR apparaat.
5. Interpretatie van resultaten
Controleer de tabel en kies het correcte kanaal.
6. Kwantificatie van resultaten
Controleer de helling/efficiëntie van de kwantitatieve curve.
Belangrijke opmerking:
Controleer de opslag condities (tijdens en na de testen) en de houdbaarheidsdatum.
Deze twee condities beïnvloeden in hoge mate de verkregen resultaten.

Real-time PCR systeem
Raadpleeg de product bijsluiter van de fabrikant.
NB:
Pleeg onderhoud aan het real-time PCR apparaat (volgens de richtlijnen van de
fabrikant).
Gelieve bij problemen/vragen contact met ons op te nemen:
Tel.: +32(0)43642050 / [email protected]
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 25
Evaluatie van de kit
1. Analytische gevoeligheid
De analytische gevoeligheid is bepaald bij een WHO internationale standaard voor menselijk
cytomegalovirus voor nucleïnezuur amplificatie technieken (Ref.: NIBSC code 09/162).
De PCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (zie punt B.3. PCR reactie instellen).
PCR condities:
Gebruikte extractie methode: EasyMag Biomerieux
Master mix: Quantifast multiplex PCR
Real-time PCR: Roche Lc480 - V50 µl
Volume van de controle: 10 µl
Een verdunning werd als positief beschouwd wanneer de relatieve fluorescentie de drempelwaarde
overschreed die door de Roche LightCycler 480 bepaald was.
Een Probit statisch model werd gebruikt om uit de resultaten de analytische gevoeligheid te
berekenen. Deze gevoeligheid wordt gegeven door de 95% positieve grenswaarde.
Dit is de target concentratie waarbij 95% van de testruns een positief resultaat geven, uitgaande
van een seriële verdunningsreeks van referentie materiaal.
Tabel 1 toont de coëfficiënten van het model dat is gefit. Een representatie van het model is
weergegeven in figuur 1.
Snijpunt
Concentratie (IU/ml)
Waarde
-7,74
3,22
Std. fout
2,25
0,89
z waarde
-3,44
3,61
Pr (>|z|)
5,86E-04
3,01E-04
Volgens het gefitte Probit model was de ondergrens van de detectie van de methode 820 IU/ml
(P > 0,05 ± 0.0522).
2. Specificiteit
De specifieke primers en probes werden met behulp van de literatuur geselecteerd (Guiver et al.,
2001). Deze werden ook gecontroleerd op mogelijke homologieën met andere bekende sequenties
met behulp van sequentieanalyse. Primers en probes worden dagelijks gebruikt in klinische
diagnostiek laboratoria op materiaal van totaal bloed/EDTA en plasma/citraat.
Een inhibitie controle sequentie is ook met behulp van sequentieanalyse gecontroleerd.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 26
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
3. Evaluatie van de diagnose
Met de cytomegalovirus real-time PCR van Diagenode werd een evaluatie uitgevoerd op
ongeveer 101 klinische totaal bloed/EDTA samples.
Deze studie diende als een vergelijking van de resultaten verkregen met de cytomegalovirus
real-time PCR van Diagenode en de resultaten verkregen met een andere CE/IVD CMV
diagnostische kit (Firma A).
De positieve en negatieve resultaten werden vooraf bepaald met de cytomegalovirus real-time
PCR van Diagenode.
Gebruikte methode:

Samples werden geëxtraheerd met QIAamp DNA mini kit (Blood and Body Fluid Spin
Protocol) (Qiagen).

Agilent Stratagene Mx3000P real-time PCR systeem.
De verkregen resultaten staan weergegeven in de onderstaande tabellen:
Klinische samples, n=101
Diagenode
n. positieve samples
47
n. negatieve samples
54
Resultaten Diagenode
Positieve resultaten Firma A
Negatieve resultaten Firma A
47 positieve samples
46
1
54 negatieve samples
2
52
Slechts drie tegenstrijdige resultaten werden waargenomen met een virale lading.
Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
PAGINA 27
Beperkingen betreffende het gebruik van het product

Alle reagentia mogen uitsluitend voor in vitro diagnostiek worden gebruikt.

Voor optimale resultaten moet de handleiding strikt worden gevolgd.

De betrouwbaarheid van de resultaten hangt af van een correcte afname, transport, opslag
en verwerking van het materiaal.

Deze test is gevalideerd voor het gebruik op materiaal uit totaal bloed/EDTA en uit
plasma/citraat.

Deze test is gevalideerd voor gebruik met de ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus™
/ Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCycler-IQ5-CFX96 / Agilent Stratagene MX3000P-3005P /
Qiagen Rotor-Gene real-time PCR systemen.
Kwaliteit controle
Diagenode heeft het ISO 9001 en het ISO 13485 certificaat behaald voor het ontwerp, de productie
en de verkoop van klinische diagnostische kits op basis van real-time PCR technologie.
De kwantitatieve cytomegalovirus real-time PCR is getest op vooraf vastgestelde specificaties om
de productkwaliteit te garanderen.
Referenties
Guiver, M., Fox, A. J., Mutton, K., Mogulkoc, N. and Egan, J. (2001). Evaluation of CMV viral
load using TaqMan CMV quantitative PCR and comparison with CMV antigenemia in heart and
lung transplant recipients. Transplantation 71, 1609-15.
www.diagenodediagnostics.com
PAGINA 28
2
DIAGEN
NODE KWANTITAT
TIEVE CYTOMEGAL
LOVIRUS REAL-TIM
ME PCR HANDLEIIDING
Verklarin
ng van symbo
olen
Catalogusnummer
Batch co
ode
Bevat vo
oldoende vo
oor <<n>> te
esten
Bovengrrens van tem
mperatuur
jjjj-mm
Houdbaarheidsdatu
um
In vitro diagnostisch
d
h medisch apparaat
Raadple
eeg handleid
ding
Biologisch risico
Controle
e
Negatiev
ve controle
Positieve controle
Niet bloo
otstellen aan
n zonlicht
Fabrikan
nt
Europe Diagenode
D
sa / LU
UIK SCIENCE PARK
P
// Rue Bois
s Saint-Jean, 3 /// 4102 Seraing (Ougrée) // België // T e l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: info
[email protected]
PAG
GINA 29
Medede
M
eling aa
an kop
per
Dit
D product is ontwikkeld
d om gebruik
kt te worden
n in de polym
merase ketting reactie (P
PCR) die va
alt onder
de
d patenten die eigendo
om zijn van Roche Mole
ecular Systems, Inc., en F. Hoffmannn-La Roche
e ltd.
(Roche).
(
Vanwege deze
e patenten wordt
w
geen liicentie voor gebruik van
n het PCR pproces explic
ciet of
impliciet ove
ergedragen aan
a de kope
er bij aankoo
op van dit prroduct. Een licentie voorr het gebruik
k van het
PCR
P
process voor bepaa
alde onderzo
oeksactiviteiiten wordt meegeleverd
m
bij de aankkoop van bep
paalde
reagentia
r
bijj gelicentiee
erde leveranc
ciers, wanne
eer gebruiktt in combinatie met een Authorized Thermal
Cycler,
C
of is verkrijgbaarr bij Applied Biosystemss. Verdere in
nformatie vo
oor het verkrrijgen van lic
centies
voor
v
het geb
bruik van het PCR proce
es kunnen w
worden verkrregen door contact
c
op tee nemen me
et de
Director
D
of L
Licensing bij Applied Bio
osystems, 85
50 Lincoln Center
C
Drive, Foster Cityy, California 94404 of
bij
b Roche Mo
olecular Sysstems, Inc, 1145
1
Atlanticc Avenue, Alameda,
A
Ca
alifornia 945001.
•
ABI (Applied Biosystems)
B
Prism 7000 of 7300 of 7500
7
of 7900HT of SteppOnePlusTM
M zijn een
ndelsmerken
n van Applera Corporat ion
han
•
n handelsme
erk van Roche
Roche LightCyycler 480 en 2.0 zijn een
•
orad iCycler of IQ5 of CF
FX96 zijn ee
en handelsm
merk van Bio
orad
Bio
•
gene MX300
00P of 3005P
P zijn een handelsmerk van Agilentt Stratagene
e
Agiilent Stratag
•
agen Rotor-G
Gene is een
n handelsme
erk van Qiag
gen
Qia
•
C
Cepheid SmarttCycler II is een handelssmerk van Cepheid
•
em is een ha
andelsmerk van Biomerieux
Nuclisens easyyMAG Syste
•
agNa pure LC
C system is een handellsmerk van Roche
R
Ma
•
Aamp UltraS
Sens Virus Kit
K (50) is ee
en handelsm
merk van Qia
agen
QIA
•
P
PCR + ROX vial kit is een ha
andelsmerk van Qiagen
QuantifastTM Probe
•
ultiplex PCR
R Kit is een h
handelsmerk van Qiage
en
Rottor-Gene Mu
•
T
Master is een
n handelsme
erk van Roch
he
LightCycler® TaqMan®
*K
Klasse Ea1: virus
v
dat zie
ekten kan ve
eroorzaken bij
b dieren en de volgendde kenmerke
en heeft
(in verschillend
de mate): be
eperkte geo
ografische om
mvang, zwakke overdraacht tussen soorten,
s
bestaande vector
v
of dra
ager. Het verreist normaa
al geen bijzo
ondere afzonnderingsmaatregelen.
onb
Er bestaat gew
woonlijk een profylaxe e n/of een doe
eltreffende behandeling
b
g
www..diagenodediagno
ostics.com
PAGINA 30
DIAGENODE KWANTITATIEVE CYTOMEGALOVIRUS REAL-TIME PCR HANDLEIDING
Europe Diagenode
sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing (Ougrée) // België // Te l . : (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]
MA-CMVQ-NL-V1_03_10_14
.
Diagenode
e sa
LUIK SCIENCE PA
ARK
an, 3
Rue Bois Saint-Jea
4102
2 Seraing (Oug
grée) - BELG IUM
Tel. +32 4 364 2 0 50
info
o@diagenode
ediagnostics.ccom
ww
ww.diagenode
ediagnostics.ccom