Transcript 11. Plaatsgerichte mutagenese

Plaatsgerichte mutagenese
Primrose & Twyman
Principles of Gene Manipulation and Genomics,
7e editie (2006), Hoofdstuk 8
- doel: enkelvoudige of enkele posities gericht wijzigen in een DNA fragment (kloon)
(enkelvoudige, gerichte wijzigingen in een genoom vergen bijzondere technieken, kunnen
ondermeer via in vivo recombinatietechnieken ; worden hier niet behandeld)
- 'reverse genetics' :
klassieke genetica : willekeurig mutaties invoeren om fenotype te creëren
=> plaats van mutatie zoeken (en karteren)
'reverse' genetica : mutatie invoeren op welbepaalde plaats
=> mogelijk effect op fenotype (functie) bekijken
- drie basisbenaderingen: (1) cassettemutagenese (2) primerverlenging (3) PCR
(klassieke) genetica
DNA
causaliteit
‘reverse genetics’
fenotype
*
Relatie tussen mutagenese-efficiëntie en het aantal kloons, nodig om de
aanwezigheid van de gewenste mutant te verzekeren, met 90% probabiliteit
Het aantal geanalyseerde kloons moet voldoende hoog zijn om met behoorlijke
kans de gewenste mutant te vinden (afhankelijk van de probabiliteit van voorkomen
van de mutatie, hetgeen afhankelijk is van de gebruikte procedure (of techniek)).
Cassettemutagenese
- excisie van een DNA fragment (restrictieknipplaatsen !)
+ vervanging door een chemisch-gesynthetiseerd fragment
(2 of meer oligonucleotiden)
- VOOR - hoge efficiëntie
- multipele uitwisseling mogelijk, inclusief degeneraties
- TEGEN - vereist flankerende "unieke" knipplaatsen
- synthesecapaciteit moet voldoende hoog zijn
- gebruik overlappende sets oligonucleotiden mogelijk (cfr. chemische synthese)
- bij complexe degeneraties : 2de streng aanmaken door fill-in (vanaf 3’ uiteinde)
- gebruik van inosine mogelijk om mismatches tussen de strengen te vermijden
- ook deleties en grote inserties zijn mogelijk
mismatch posities
Uitwisseling van restrictiefragmenten
gebruik van inosine op gerandomiseerde posities
(N hoeft niet per se 25% van elk te zijn, maar kan ook bvb. 97% van het
oorspronkelijke nucleotide en 1% van elk van de 3 andere)
nb. alleen Met en Trp vereisen een G op de derde positie van het triplet, voor de andere
18 volstaat een C of G (m.a.w. hun derde letter is Y of R, voor Ile is dit H).
=> NNS vertegenwoordigt dus de 20 mogelijke aminozuren (inclusief het oorspronkelijke)
Vooral de beperking door de noodzakelijke unieke (of bijna-unieke) restrictieknipplaatsen, maakte
dat gezocht werd naar methoden met mismatch-primer-afhankelijke invulreacties, en later op
basis PCR.
Mismatch primerverlenging ('primer extension')
=> oligonucleotide-gestuurd, mismatch-afhankelijk
- vereist enkelstreng matrijs (eventueel partiëel enkelstrengig)
- M13- of fasmide kloon
- aanmaak van gapped-duplex
- vereist mismatch oligonucleotide (chemische synthese)
- belang van positie van mismatch in oligonucleotide op matrijs
- 3'-effect (repair)
=> keuze polymerase !
- 5'-effect (displacement)
=> keuze polymerase !
- mogelijkheden: puntmutatie, multipele puntmutaties, insertie, deletie
(ook 'sticky feet‘ mutagenese genoemd)
- efficiëntie is (zeer) laag tenzij bijzondere maatregelen genomen worden
waarom ? => afhankelijk van diverse factoren
- transformatie door heteroduplex EN de oorspronkelijke matrijs (ss)
=> de oorspronkelijke (ss) matrijs geeft alleen niet-mutante transformanten
- herstelmechanismen in E.coli (GATC !)
=> gebruik van mutL, mutS, mutH stammen
Mutagenese door
mismatch primer
verlenging op een
enkelstrengige
matrijs
5’
3’
T
C
*
Enkelvoudige of meervoudige puntmutaties, insertiemutations en deletiemutaties
zijn mogelijk.
Hoofdbekommernis is de efficiëntie van screening.
A repair enzyme, MutS, binds to mismatches in
DNA and recruits MutL, which subsequently
activates the endonuclease MutH. MutH binds
hemimethylated GATC sites (which can be up to
1 kb from the mismatch) and when activated will
selectively cleave the unmethylated daughter
strand, allowing a specific helicase and
exonucleases to excise the nascent strand in the
region surrounding the mismatch. The strand is
then re-synthesized by DNA polymerase III.
Theoretisch concept, geeft
50% wild-type en 50 mutante
nakomelingen.
maar :
ook de enkelstrengige moleculen
transformeren de waardcel, zodat meer
wild-type dan mutante kloons worden
gevormd ;
bovendien :
herstelmechanismen favoriseren de
originele sequentie.
Selectie van de mutante streng : belangrijkste voorbeelden
(vaak ook gemodificeerde oligonucleotiden of modificaties in de mismatch primer mogelijk, bvb. met inosine)
- methode van Eckstein :
- in vitro fixering van de mutatie
- gebruik van fosforothioaat nucleotiden (aS-dCTP)
- kenmerken van restrictieënzymen tegenover de S-modificatie
- methode van Kunkel :
- in vivo selectie van de mutant
- "doping“ van de matrijsstreng met uridylaat : 1 à 2 % U waar T thuishoort
- dubbelmutant : dut (voor dUTPase)
ung (voor uracil-N-glycosidase)
- transformatie van de mismatch dubbelstreng naar een wt E.coli
Methode van Eckstein
Introduceer een S-gemodificeerde streng
Sommige restrictieënzymen worden
geïnhibiteerd door S-modificatie, maar
splitsen wel nog de niet-gemodificeerde
streng (=> nicking) : bvb. NciI
Exonuclease III verwijdert de mismatch,
maar alleen uit de parentale streng
vereist :
- vervanging van een dXMP door zijn
zwavel-analoog op alle plaatsen
- volledige kopiëring, en ringsluiting
door ligase
Structuur van dCTPaS :
het Sp isomeer wordt specifiek gebruikt door E. coli DNA polymerase I
De biochemie achter de
methode van Kunkel voor
plaatsgerichte mutagenese
Metabolisme van dUTP in E. coli
Pijlen geven de richting aan van
de omzettingen in de algemene
pathway eerder dan het evenwicht
bij de individuele reacties.
Pijlen in vetjes duiden de majeure
pathway aan.
In de kadertjes staan de namen
van de betrokken genen :
ung : uracil-DNA N-glycosylase
dut : dUTPase
dcd : dCTP deaminase
cdd : (deoxy)cytidine deaminase
deoA : thymidine phosphorylase
(deoxyuridine)
20-30 dU’s in M13mp2 DNA bij
isolatie uit een dut ung E.coli
stam.
dCyd : deoxycytidine ; dUrd : deoxyuridine ; dThd : deoxythymidine
dRib-1-P : deoxyribose-1-fosfaat
Vergelijking tussen strategie
van Eckstein en van Kunkel.
Kunkel :
=> de matrijsstreng wordt
gemodificeerd ;
=> via "manipulaties" in vivo
Eckstein :
=> de nieuwe streng wordt
gemodificeerd;
=> manipulaties in vitro
nb. Kunkel methode :
Diverse variaties werden getest, met al dan
niet toevoeging van een in vitro ligatiestap,
met al dan niet een uracil glycosylasestap, en
deze al dan niet gevolgd door reactie in alkali.
Het beste resultaat, qua aantal kloons en aantal
mutanten werd echter bekomen, met alleen de
ligatiestap na mismatch-primer extensie. (En
dus herstelreacties voornamelijk in vivo.)
Hybridisatie van twee lineaire DNA fragmenten, of één circulair DNA (de vector) met een
complementaire streng die er deels mee overlapt (= vorming van de gap) ; tussen beide is
een extra selecteerbare mismatch aanwezig, waardoor selectie van de mutant mogelijk is.
Ook mogelijk met 2 (of 3) mismatch primers op een circulaire vector. Telkens hierbij is
behoud van “koppeling” tussen de segmenten is noodzakelijk.
- gapped duplex methode, met extra (= begeleidende) mismatch tgo de complementaire streng
- transformatie naar een niet-suppressor stam (Su-)
- expressie vanaf de parentale streng vereist een amber suppressor
- gapped duplex method, met alternerende (= omwisselbare) ambermutaties :
- Apam => ApR en CmR => Cmam, en vice versa
- steeds transformatie naar een Su- stam
- maakt consecutieve mutageneses makkelijker
- in vivo selectie met een wijziging in de selectiemerker
- toevoeging van een selectieprimer die het bla gen wijzigt
- het mutante bla gen geeft resistentie tegen ceftazidime + ampicilline
- niet-mutante transformanten overleven niet op ceftazidime
- T4 polymerase vult de openingen (gaps) nauwkeurig in
(geen 5'-3' exo, geen ‘strand displacement’)
- er is een goede koppeling tussen de mismatchen
m.a.w. geen cross-over : aanwezigheid van beide gaat samen
In vitro mutagenese met de ‘gapped duplex’ methode en fenotypische selectie
door amber-suppressie
Omwisseling van waardcel
tussen “amber-suppressing”
en “non-suppressing” fenotype.
Selectie door gebruik van de
niet-suppresserende waardcel.
“Gapped duplex” methode met fenotypische selectie
Omwisseling tussen twee
resistentiegenen, rekening
houdend met de
suppressie-fenotypes.
Volle balk : wild-type gen
Open balk : ambermutant
Amps en Cms staan voor Ampam en Cmam
Gebruik van kloons in fasmidevectoren voor
aanmaak van de enkelstrengige matrijsstreng.
Met gebruik van 2 mismatch oligonucleotiden
Selectie van mutanten door een extra mutatie in
een bla gen zodat ceftazidime resistentie ontstaat.
De "begeleidende" mutatie wijzigt het bla gen
mutante TEM bla
S
K
G
5´ p AAA TCT GGA GCC TCC AAG GGT GGG TCT CGC
aaa tct gga gcc GGT GAG Cgt ggg tct cgc
wild-type TEM bla
Ter illustratie
Ceftazidime
G
E
R
3´
PCR-gebaseerde plaats-specifieke mutagenese
- uitschakeling van de parentale matrijs door amplificatie
- mismatch primer op de doelwitpositie
=> bij “terugpriming” (in 2de cyclus) wordt de wijziging gefixeerd
- uitbreiding van cassettemutagenese, maar de regio’s (fragmenten) kunnen veel groter zijn ;
restrictieplaats "in de omgeving" van de mismatch is nodig, maar dat mag
niettemin op een redelijke afstand zijn (bvb. 25 of zelfs meer nucleotiden, zolang
de primer synthetiseerbaar blijft)
- de nood aan restrictieplaats kan omzeild worden door een werkwijze die sterk op SOE lijkt
- 'megaprimer' mutagenese: tweestapsprocedure, waarin het vroege ampliconproduct
de primer wordt in de daaropvolgende amplificatie
- door inverse PCR : indien de vector klein genoeg is
- lineair product
- circularisatie nodig
- een splitsingsplaats is weerom zeer nuttig
- primers met staarten maken substantiële inserties mogelijk
- “universele” methode met Class-II restrictieplaatsen en enzymen
De megaprimer methode
De mutante moleculen gevormd in de eerste PCR-rondes fungeren als primers in de latere cycli van de PCR.
Aanpassingen van “inverse PCR” :
Linearisering bij : na amplificatie opnieuw
splitsing aan de uiteinden en ligatie.
=> vereist dus een knipplaats “in de buurt”
(en uniek in de vector)
ook langere inserties kunnen gecrëëerd worden
Gebruik van EarI of andere ClassII-S enzymen
EarI : afsplitsing van extra "staarten"
C T C T T C (1 / 4)
PCR
EarI
herkenningssequentie van EarI
----CTCTTCn
----GAGAAGnnnn
EarI
EarI
ligase
Andere alternatieven :
- ExsiteTM methode : tegenselectie met DpnI
- GeneTailorTM methode : in vitro C-methylatie en in vivo afbraak van parentale streng
De PCR methoden zijn een majeure benadering geworden voor gerichte mutagenese
- VOOR - efficientie zo goed als 100% (onder optimale condities)
- eenvoud
- TEGEN - het product is lineair: inbouw in een vector of circularisatie is
nodig om het amplicon te kloneren
- risico van extra mutaties (in de rest van het amplicon)
=> sequencing van het ganse amplicon nodig
=> keuze van polymerase is belangrijk
... veel andere alternatieven, met ondermeer meervoudige gerichte mutaties
op een welbepaalde plaats in een coderende sequentie, insertie van
ongewone aminozuren, gene shuffling, enz.
'ExsiteTM' -methode
Plasmide DNA uit een dam+ stam
Inverse PCR met 5'-gefosforyleerde primers
(T4-kinase + ATP)
Behandeling met DpnI vernietigt de parentale
strengen (GmeATC) (inclusief de hemi-gemethyleerde)
Circularisatie met ligase
en transformatie van E. coli
'GeneTailor' -methode
In vitro methylatie van het plasmide DNA (meC)
Amplificatie via inverse PCR met overlappende
5'-uiteinden (+ één mismatch primer)
Transformatie van een E. coli wt-stam (mcrBC+)
McrBC endonuclease vernietigt de
gemethyleerde matrijsstreng
De 'repair'-enzymen circulariseren het linaire
product.
E. coli McrBC is een restrictieënzym dat splitst bij C-gemethyleerde
RC sequenties.
CpG methylase kan in deze techniek gebruikt worden voor
methylering (M.SssI) aangezien een deel van deze sequenties wel zal
voorafgegaan worden door een purine-nucleotide.
Detectie (bevestiging) van mutanten
- fysisch: ontstaan of verdwijnen van een knipplaats (restrictieanalyse)
(reverse-translation analyse naar mogelijke manipulatie)
- sequencing: extra primer nodig op korte afstand van de mismatch positie
- hybridisatie: +/- analyse met de mismatch-primer
*
any aa
Codewoord tabel voor ‘reverse translation’
Leu = 1T2
Arg = 3G4
Ser = 567
met 1,2,3,4,5,6,7 als conditionele codes waarbij een extra relatie tussen de tripletposities is
(1 versus 3, of 1 versus 2 en 3)
*
Creëren of verwijderen van een restrictieknipplaats als hulp
bij screening naar plaatsspecifieke mutanten
Doel : vervangen Trp door Phe
Hulp bij screening : MnlI splitsing
Mismatch primer :
…GCCCTGGGCTTCGGTGGCA…