Transcript 26 februari 2015

A
Extr ct
25-hydroxy-vitamine D3, van HPLC-UV naar
UPLC-MS
Erik Olyslager 2, Stephan Kamphuis 1.
1 Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium
2 Klinisch Farmaceutisch & Toxicologisch Laboratorium
Postbus 9014
7300 DS Apeldoorn
[email protected]
www.docfrog.nl
in verband gebracht met een verhoogd risico op bovenste
luchtweginfecties, astma, auto-immuunziekten en diverse
typen maligniteiten, zoals prostaat-, colon- en borstkanker.
Een tekort is gerelateerd aan het optreden van hartfalen.
De Nederlandse Gezondheidsraad adviseert daarom voor
25-hydroxyvitamine D momenteel een algemene ondergrens
van 30 nmol/l en voor vrouwen ≥ 50 jaar en mannen ≥ 70
jaar een ondergrens van 50 nmol/l (2).
Inleiding
Internationale experts pleiten voor een serumconcentratie
25-hydroxyvitamine
D van tenminste 75 nmol/l (3,4) ten behoeve van de nietcalcaemische functies en kankerpreventie (5). Nederlandse
laboratoria houden gemiddeld genomen 50 nmol/l
25-hydroxyvitamine D als minimum aan voor alle seizoenen
en leeftijden, conform voorgesteld Europees beleid, en 75 of
80 nmol/l als streefwaarde (6).
Het laboratoriumonderzoek op lichaamsvreemde stoffen
wordt in Nederland meestal verricht in laboratoria van
ziekenhuisapotheken, waarbij lichaamseigen stoffen veelal
worden bepaald in klinisch chemische laboratoria. In ons
apotheeklaboratorium maken we o.a. gebruik van HPLC
technieken en hiermee worden meerdere vitaminebepalingen
uitgevoerd. Tot ongeveer een jaar geleden werd voor de
vitamine D analyse een standaard applicatie gebruikt van
de firma “Chromsystems”. Deze standaard applicatie maakt
gebruik van HPLC in combinatie met UV detectie. Door de
mindere aspecten van deze applicatie waaronder lange
analysetijd, matige sensitiviteit en bewerkelijke monstervoorbewerking, is de applicatie omgezet naar UPLC-MS.
Vitamine D
Vitamine D is een groep van in vet oplosbare prohormonen,
waarvan de twee belangrijkste vormen vitamine D2 (ergocalciferol, de plantaardige vorm) en vitamine D3 (cholecalciferol, de dierlijke vorm) zijn. Vitamine D3 kan in het menselijk lichaam worden aangemaakt onder invloed van ultraviolet
licht van de zon. De endogene synthese (>90%) is veelal
ontoereikend waardoor aanvoer uit externe aanvoer noodzakelijk blijft.
Vitamine D3 wordt vaak gezien als prohormoon, en is de
precursor bij de 25-hydroxylering en 1-hydroxylering in
respectievelijk lever en nieren, waarna het actieve hormoon
1,25-dihydroxyvitamine D wordt geproduceerd (1). Vitamine
D speelt een belangrijke rol in diverse orgaansystemen,
waaronder de darmen, nieren, bot en de bijschildklieren.
Indien geen nier en/of leverproblemen aanwezig zijn kan
volstaan worden met alleen een meting van 25-OH vitamine
D (Vit. D3).
Vitamine D is tegenwoordig een hot topic en wordt veelvuldig
kritisch besproken in diverse medische discussies zowel
internationaal als nationaal. Een lage vitamine D-status wordt
44
Aangezien het aantal aanvragen voor vitamine D de
laatste jaren erg is toegenomen is het zeer wenselijk om
een kwalitatief goede bepaling in huis te hebben die snel,
gevoelig en goedkoop is.
Materiaal en Methode
Chemicaliën en apparatuur
Leveranciers
Ammoniumformiaat, mierenzuur en methanol: Fluka.
Ammonia, natriumhydroxyde (NaOH) en zinksulfaatheptahydraat: Merck.
Standaarden: Chromsystems.
Controles: UTAK.
SPE blok :
HPLC
:
Detector :
Kolom
:
Waters Positive Pressure-96 Processor
Waters ACQUITY UPLC
Waters Quattro Premier
Waters CSH C18, lengte : 50 mm, diameter :
2,1 mm, deeltjes grootte: 1,7 µm
µElutie 96
well plate : Waters OASIS HLB, 2 mg, 30 µm
A
Extr ct
UPLC instellingen
96 kanaaltjes boven elke well voor een gecontroleerde
vloeistofstroom door de 96 kolommetjes van de plaat.
Zo kunnen snel 96 monsters parallel opgewerkt worden.
Eluens A
: 5 mM ammoniumformiaatbuffer pH=3,0
Eluens B
: methanol met 0,1% mierenzuur
Gradient
(curve lineair): t=0 : 80% B
t=0,7 : 80% B
t=2,0 : 95% B
t=3,0 : 95% B
t=3,01: 80% B
t=4,0 : 80% B
Flow
: 0,4 ml/min
Injectievolume
Injectievolume : 10 µl : 10 µl
Kolom
temperatuur
: 40°C : 40°C
Kolom
temperatuur
2.3 MassaSpectrofotometer
(MS) instellingen
MassaSpectrofotometer
(MS) instellingen
Stof
25-hydroxy-vitamine-D3
Moeder ion
401,48
D3-25-hydroxy-vitamine-D3
(interne standaard)
25-hydroxy-vitamine-D2
404,49
413,44
- M.b.v. SPE OASIS HLB 2 mg 96-well micro elutie plaat:
- Conditioneer met 200 µl methanol en 200 µl water.
- Pipetteer 100 µl water op de kolommetjes.
- Breng de bovenlaag van reageerbuis op de kolommetjes
en elueer op lage flow.
- Was met 500 µl water.
- Was met 200 µl 50% methanol in water en trek droog.
- Plaats een 96 well collection plate onder de 96-well plaat.
- Elueer met 100 µl 0,1% mierenzuur in acetonitril.
- Elueer met 100 µl 5 mM ammoniumformiaatbuffer pH=3,0.
- Zet de collection plate in de UPLC en injecteer 10 µl.
Dochter ion
365,2
383,3
368,3
386,3
355,2
395,2
Cone (V)
20
20
15
15
15
15
Collision energie (V)
10
10
10
10
12
10
Standaarden
2.4 Standaarden
Interne standaard:
Interne
standaard :
400
µg/l D3-25-hydroxy-vitamine-D3
in acetonitril.
400 µg/l D3-25-hydroxy-vitamine-D3 in acetonitril.
Een Chromsystems kalibrator wordt voor het begin van
een
reeks
in 3-voud opgewerkt
en later inwordt
de reeks
2 keer
Een
Chromsystems
kalibrator
voor
het begin van een reeks in 3-voud opgewerkt en later in de reeks 2
meegenomen.
Door
al
deze
standaarden
mee
te
nemen
keer meegenomen. Door al deze standaarden mee te nemen in de kalibratie wordt een 1 punts kalibratie in
in5-voud
de kalibratie
wordt een 1 punts kalibratie in 5-voud
verkregen.
verkregen.
Naast de standaard worden 3 levels van UTAK (25, 67 en 185 nmol/l) meegenomen verdeeld over de reeks.
Naast de standaard worden 3 levels van UTAK (25, 67 en
185
nmol/l)
meegenomen verdeeld over de reeks.
2.5
Monstervoorbewerking
Monstervoorbewerking
Pipetteer in kleine glazen reageerbuisjes achtereenvolgens:
Positive Pressure-96 Processor
200 µlinserum
en 50
µl interne achtereenvolgens:
standaard.
Pipetteer
kleine glazen
reageerbuisjes
Voeg
40 µl
toe om de eiwitbinding te breken.
200
µl serum
en 4M
50 µlnatriumhydroxide
interne standaard.
Vortex
en laat 10 minuten
in het
Voeg
40 µl kort
4M natriumhydroxide
toe om destaan
eiwitbinding
te donker.
Voeg 200 µl 0,1 M zinksulfaat en 200 µl acetonitril toe.
breken.
Vortex
zet vervolgens
20 minuten in de koelkast.
Vortex
kort even
en laaten
10 minuten
staan in het minimaal
donker.
Voeg
200 µl 0,1 M 4
zinksulfaat
en bij
2004500
µl acetonitril
Centrifugeer
minuten
rpm.toe.
Vortex even en zet vervolgens minimaal 20 minuten in de
koelkast.
Extractie
Centrifugeer
4 minuten
bij 4500
rpm.
Voor de Solid
Phase
Extraction
(SPE) maken we gebruik van een 96-well micro elutie plaat. Met deze platen
werken we 96 monsters in één keer op. De extractie wordt uitgevoerd met een Positive Pressure-96
Extractie
Processor van Waters. Dit apparaat zorgt d.m.v. een positieve stikstof druk op de 96 kanaaltjes boven elke
Voor
Solid Phase
Extraction (SPE) maken
we gebruik van door de 96 kolommetjes van de plaat. Zo kunnen snel 96
welldevoor
een gecontroleerde
vloeistofstroom
een
96-well
micro
elutie
plaat.
Met
deze
platen
werken we
monsters parallel opgewerkt worden.
96 monsters in één keer op. De extractie wordt uitgevoerd
met
een Positive
Processor
Waters.micro elutie plaat:
- M.b.v.
SPEPressure-96
OASIS HLB
2 mg van
96-well
Positive Pressure-96 Processor in gebruik
Dit apparaat zorgt d.m.v. een positieve stikstof druk op de
-
Conditioneer met 200 µl methanol en 200 µl water.
Pipetteer 100 µl water op de kolommetjes.
Breng de bovenlaag van reageerbuis op de kolommetjes en elueer op lage flow.
Was met 500 µl water.
Was met 200 µl 50% methanol in water en trek droog.
Plaats een 96 well collection plate onder de 96-well plaat.
Elueer met 100 µl 0,1% mierenzuur in acetonitril.
Elueer met 100 µl 5 mM ammoniumformiaatbuffer pH=3,0.
Zet de collection plate in de UPLC en injecteer 10 µl.
45
A
Extr ct
Resultaten / discussie
MS overgangen
In verband met de seriegrootte was het plan om over te stappen naar gebruik van 96 well platen. Samen met de Positive
Pressure-96 Processor gaan de SPE stappen snel en
gemakkelijk. De opgevangen eluenten kunnen rechtstreeks
vanuit de 96-well Sample Collection Plate geïnjecteerd worden, waarvan indien nodig 2 stuks in de UPLC gezet kunnen
worden. Zo kunnen er zonder modificatie aan het systeem in
1 nacht 192 monsters weggewerkt worden.
In de literatuur worden regelmatig LCMS methodes gepubliceerd voor de bepaling van 25-hydroxy-vitamine D.
De chromatografie-methoden zijn bij de meeste artikelen
weinig verschillend. Meestal betreft het een combinatie van
0,1M mierenzuur met methanol wat is aangezuurd met
mierenzuur. Bij de keuze van de massa overgangen worden
Toch waren er wel een aantal aanloopproblemen op te lossen
wel verschillen waargenomen. Soms is de molecuulmassa
alvorens een goed werkbare SPE methode beschikbaar was
+H-H2O (389) als moeder gekozen. Daarbij worden dan
waarmee we naar tevredenheid konden werken. Het eerste
bijvoorbeeld dochters 211 en 229 gevonden (7). Op ons
probleem was de eiwitbinding. Serum, al dan niet verdund
laboratorium kwam tijdens het bepalen van de dochters
met water over een SPE kolom levert slechts zeer kleine
het fragment 389 als grootste tevoorschijn. In sommige
pieken op. Er moet eerst ont-eiwit worden. Ont-eiwitten met
Inpublicaties
de literatuur
worden
regelmatig ion
LCMS
methodes
gepubliceerd voor de bepaling van 25-hydroxy-vitamine
wordt dit
ion als kwantificerings
gebruikt
(8,9).
methanol bleek in ieder geval aanmerkelijk minder effectief
D.Naast
De chromatografie-methoden
zijn
de meeste
artikelen weinig verschillend. Meestal betreft het een
389 werden tevens 365, 159 en 105
alsbij
dochter
ion
dan ont-eiwitten met acetonitril. Met mierenzuur aangezuurde
combinatie
vanfragment
0,1M mierenzuur
met methanol
met mierenzuur. Bij de keuze van de
gevonden. Voor
105 is een behoorlijk
hoge collisionwat is aangezuurd
acetonitril (2%) of puur acetonitril maakte geen verschil.
massa
overgangen
worden
wel
verschillen
waargenomen.
Soms
is
de
molecuulmassa+H-H2O (389) als
energie nodig wat resulteert in een nogal druk fragmentatie
moeder
gekozen.
Daarbij
worden
dan
bijvoorbeeld
dochters
211
en
229
gevonden (7). Op ons laboratorium
patroon. De keuze voor 389 ligt niet voor de hand omdat dit
Bij onze uitgangsmethode werd 200 µl serum samen met
kwam
tijdens
het
bepalen
van
de
dochters
het
fragment
389
als
grootste
tevoorschijn. In sommige
ion voortkomt uit waterverlies ook al is deze duidelijk het
50 µl interne standaard en 250 µl acetonitril geschud, in de
publicaties
wordt
dit
ion
als
kwantificerings
ion
gebruikt
(8,9).
Naast
389
werden
tevens 365, 159 en 105 als
grootst (een factor 3 groter dan 365 of 159). Dit heeft geresulkoelkast gezet en vervolgens gecentrifugeerd. De bovenlaag
dochter
ion
gevonden.
Voor
fragment
105
is
een
behoorlijk
hoge
collision
energie
nodig wat resulteert in een
teerd in de keuze voor het kwantificerings ion 365 wat
bevatte ca. 60% acetonitril.
nogal
druk
fragmentatie
patroon.
De
keuze
voor
389
ligt
niet
voor
de
hand
omdat
dit ion voortkomt uit
eventueel ook 159 had kunnen zijn. Als qualifier wordt dan
Deze bovenlaag werd op losse 1 ml OASIS HLB SPE
waterverlies
ook
al
is
deze
duidelijk
het
grootst
(een
factor
3
groter
dan
365
of
159).
Dit heeft geresulteerd
wel 389 meegenomen.
kolommetjes met 10 mg sorbent gebracht. Ondanks het hoge
in de keuze voor het kwantificerings ion 365 wat eventueel ook 159 had kunnen zijn. Als qualifier wordt dan
acetonitril gehalte werd 25-OH-vitamine-D vastgehouden
wel 389 meegenomen.
op de kolommetjes. De 96-well µElutieplaat bevat per
Monstervoorbewerking
kolommetje echter maar 2 mg sorbent. Dit bleek te weinig
Monstervoorbewerking
Het grootste deel van de methodeontwikkeling is besteed
met aan
als gevolg
dat de 25-OH-vitamine-D ging In
doorbreken
Het
deel van de methodeontwikkeling
de monstervoorbewerking.
een aantal
aangrootste
de monstervoorbewerking.
In een aantal publicaties is besteed
tijdens
het
opbrengen
van
de
bovenlaag.
publicaties
wordt
gewerkt
met
een
vloeistof-vloeistof
extractie
met
heptaan
of
hexaan
(10,11).
Een
wordt gewerkt met een vloeistof-vloeistof extractie met
De voorlopige
conclusie
was dat de
methodedoor
nadereen
aangecombinatie
van
neerslaan
met
acetonitril
of
methanol
eventueel
met
zinksulfaat
gevolgd
extractie
heptaan of hexaan (10,11). Een combinatie van neerslaan
past moest
worden. De eiwitbinding
moet
goed
verbroken
met
heptaan
(of
hexaan)
blijkt
ook
bij
ons
goed
te
werken.
De
belangrijkste
nadelen
van
deze
methode
zijn
met acetonitril of methanol eventueel met zinksulfaat gevolgd
worden en gevolgd
er mag nietdoor
te veelhet
acetonitril
in de bovenlaag
echter
de
emulsie
vorming,
het
overbrengen
van
de
bovenlaag
indampen
hetgeen
nogal
door een extractie met heptaan (of hexaan) blijkt ook bij ons
zitten.lastig te automatiseren. Het vervolgonderzoek
veel
tijd kost bij zulke grote series en het proces is tevens
goed te werken. De belangrijkste nadelen van deze methode
richtte
zich derhalve meer op de SPE monstervoorbewerking.
zijn echter de emulsie vorming, het overbrengen van de
Nastappen
onderzoeknaar
bleek gebruik
dat het maximale
percentage
acetonitril
In verband met de seriegrootte was het plan om over te
van 96
well platen.
Samen
bovenlaag gevolgd door het indampen hetgeen nogal veel
zonder
dat
er
25-OH-D3
doorbraak
plaatsvond
ongeveer
met de Positive Pressure-96 Processor gaan de SPE stappen snel en gemakkelijk. De opgevangen eluenten
tijd kost bij zulke grote series en het proces is tevens lastig
40%
is, bij geïnjecteerd
2 mg sorbent OASIS
HLB. Inwaarvan
eerste instantie
is nodig 2
kunnen rechtstreeks vanuit de 96-well Sample Collection
Plate
worden,
indien
te automatiseren. Het vervolgonderzoek richtte zich derhalve
geprobeerd
de acetonitrilaan
concentratie
te verlagen
met 192
stuks in de UPLC gezet kunnen worden. Zo kunnen er zonder
modificatie
het systeem
in 1door
nacht
meer op de SPE monstervoorbewerking.
een combinatie van zinksulfaat en acetonitril te werken,
monsters weggewerkt worden.
hetgeen geen optimale resultaten opleverde. Door het serum
basisch te maken met 4 M NaOH en minimaal 10 minuten te
incuberen is geprobeerd de eiwitbinding beter te breken.
Om niet teveel acetonitril in de oplossing te krijgen is na
incubatie met NaOH, 200 µl water toegevoegd gevolgd door
200 µl acetonitril. Na 10 minuten in de koelkast bleek dat
de patiënten monsters niet goed waren te centrifugeren.
Er bleef neerslag rondzweven of deels drijven waarschijnlijk
veroorzaakt door het scheiden van de basische waterlaag
en de acetonitril laag. Vervangen van de 200 µl water door
200 µl 0,1 M zinksulfaat gaf wel heldere bovenlagen. Deze
bovenlaag van ca. 650 µl bevat nu 36% acetonitril. Dit is
voldoende laag om de 25-OH-vitamine-D3 vast te laten
houden. Na elueren van de nogal basische bovenlaag wordt
water
gewassenplates
en vervolgens nog eens met 200 µl
Sample manager
van de manager
UPLC met 2van
96 well
collection
Afbeelding
3 : sample
de UPLC
met 2 96met
well
collection
plates
50% methanol hetgeen resulteerde in schone extracten.
Toch waren er wel een aantal aanloopproblemen op te lossen alvorens een goed werkbare SPE methode
beschikbaar was waarmee we naar tevredenheid konden werken. Het eerste probleem was de eiwitbinding.
Serum, al dan niet verdund met water over een SPE kolom levert slechts zeer kleine pieken op. Er moet
eerst ont-eiwit worden. Ont-eiwitten met methanol bleek in ieder geval aanmerkelijk minder effectief dan
46
ont-eiwitten
met acetonitril. Met mierenzuur aangezuurde acetonitril (2%) of puur acetonitril maakte geen
verschil. Bij onze uitgangsmethode werd 200 µl serum samen met 50 µl interne standaard en 250 µl
acetonitril geschud, in de koelkast gezet en vervolgens gecentrifugeerd. De bovenlaag bevatte ca. 60%
acetonitril.
Deze bovenlaag werd op losse 1 ml OASIS HLB SPE kolommetjes met 10 mg sorbent gebracht. Ondanks het
A
Extr ct
drijven waarschijnlijk veroorzaakt door het scheiden van de basische waterlaag en de acetonitril laag.
UPLC versus
HPLC veroorzaakt door het scheiden van de basische waterlaag en de acetonitril laag.
drijven
waarschijnlijk
Vervangen van de 200 µl water door 200 µl 0,1 M zinksulfaat gaf wel heldere bovenlagen. Deze bovenlaag
Vervangen van de 200 µl water door 200 µl 0,1 M zinksulfaat gaf wel heldere bovenlagen. Deze bovenlaag
van
ca. 650van
µl de
bevat
36% acetonitril.
is voldoende laag om de 25-OH-vitamine-D3 vast te laten
De overgang
oudenu
HPLC-UV
methode naarDit
UPLC-MS
van ca. 650 µl bevat nu 36% acetonitril. Dit is voldoende laag om de 25-OH-vitamine-D3 vast te laten
houden.
Na elueren
van
nogal
basische
bovenlaag
wordt met water gewassen en vervolgens nog eens
heeft tot gevolg
gehad dat
de de
runtijden
zijn
gehalveerd
en de
houden. Na elueren van de nogal basische bovenlaag wordt met water gewassen en vervolgens nog eens
met
200 µl sterk
50%ismethanol
hetgeen
resulteerde in schone extracten.
gevoeligheid
toegenomen.
Die gevoeligheidswinst
met 200 µl 50% methanol hetgeen resulteerde in schone extracten.
wordt mede veroorzaakt door de aan de MS gekoppelde
Figuur 1:
Figuur 2:
UPLC. De piekbreedte van 25-OH-D3 met de gebruikte
chromatogram
chromatogram
UPLC
versus
HPLC4 a 5 seconden. Met de oorspronkeUPLC kolom
is slechts
UPLC versus HPLC
van 500
µl opgeµl opge- zijn
De
van was
de oude
HPLC-UV
methode naar UPLC-MS
heeft
tot gevolg gehad van
dat 200
de runtijden
lijkeovergang
HPLC methode
deze ruim
20 seconden.
werktheeft
patiënten
De overgang van de oude HPLC-UV methode naar UPLC-MS
tot gevolg gehad werkte
dat dekalibrator
runtijden zijn
gehalveerd
en devan
gevoeligheid
sterk
is toegenomen.
Diemonster
gevoeligheidswinst
wordt mede veroorzaakt door de
Een chromatogram
een patiënt met
een redelijke
conmet 112
met 92veroorzaakt
nmol/l
gehalveerd
en de gevoeligheid
sterk
is toegenomen.
Die gevoeligheidswinst
wordt mede
door de
aan
de MS
gekoppelde
UPLC.met
De piekbreedte
van 25-OH-D3
de gebruikte UPLC25-OH-vitaminekolom is slechts 4 a 5
nmol/lmet
25-OHcentratie
25-OH-D3
geanalyseerd
HPLC methode
aan
de MS
gekoppelde
UPLC. Dedie
piekbreedte
van 25-OH-D3
met
de gebruikte UPLC kolom is slechts 4 a 5
seconden.
Met de
oorspronkelijke
HPLC methode
deze
ruim 20met
seconden. Een chromatogram
vitamine-D3
D3 met daarnaastvan een
is te zien in figuur
figuur 2 is een chromatogram
te zien was
seconden.
Met 1.
deInoorspronkelijke
HPLC methode
was deze
ruim 20
Een chromatogram van een
daarnaast
eenseconden.
uit- HPLC methode
de uitvergroting
patiënt
met eengeanalyseerd
redelijke concentratie
25-OH-D3
geanalyseerd
met
die
is te zien in figuur 1.
van
een
kalibrator
met
de
nieuwe
methode.
patiënt met een redelijke concentratie 25-OH-D3 geanalyseerd
met
methode
is 25-OHte zien in figuur 1.
vergroting
van die
de HPLC
van de
In
figuur
2 is een ischromatogram
te zien van
een kalibrator
geanalyseerd
met de nieuwe
methode. In dit
In
dit
chromatogram
ook
de
iets
later
eluerende
25-OHIn figuur 2 is een chromatogram te zien van een kalibrator
geanalyseerd
methode.
dit
vitamine
D3 piek. met de nieuwe
vitamine-D3
piek. In
chromatogram
is ook
de ietsmaar
later
eluerende
25-OH-D2 piek te zien welke in monsters
maar zelden
wordt
D2 piek te zien welke
in monsters
zelden
wordt aanInjectievolume:
Injectievolume:
chromatogram
is ook
de iets later
eluerende
25-OH-D2 piek
te zien welke in monsters
maar zelden wordt
aangetroffen.
50 µl
getroffen.
10 µl
aangetroffen.
Figuur 1 : chromatogram van 500 µl opgewerkt patiënten monster met 112 nmol/l 25-OH-vitamine-D3 met
1 Figuur 1 : chromatogram van 500 µl opgewerkt patiënten monster met 112 nmol/l 25-OH-vitamine-D3 met
daarnaast een uitvergroting van de vitamine D3 piek. Injectievolume : 50 µl
daarnaast een uitvergroting van de vitamine D3 piek. Injectievolume : 50 µl
2
Figuur 2 : chromatogram van 200 µl opgewerkte kalibrator met 92 nmol/l 25-OH-vitamine-D3 met
Figuur 2 : chromatogram van 200 µl opgewerkte kalibrator met 92 nmol/l 25-OH-vitamine-D3 met
daarnaast de uitvergroting van de 25-OH-vitamine-D3 piek. Injectievolume : 10 µl
daarnaast de uitvergroting van de 25-OH-vitamine-D3 piek. Injectievolume : 10 µl
4. Conclusie
4. Conclusie
47
51
A
Extr ct
Conclusie
De omzetting van HPLC-UV naar de UPLC-MS methode
voor de detectie van 25-OH vitamine D3 brengt veel voordelen met zich mee, waaronder snellere analyses, detectie
van lagere levels van Vitamine D3 en lagere kosten.
References
1 Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med. 2007;
357:266-281.
2 Gezondheidsraad. Naar een toereikende inname van
vitamine D. 2008.
3 Dawson-Hughes B, Heaney RP, Holick MF, et al.
Estimates of optimal vitamin D status. Osteoporosis
Int. 2005;16:713-6.
4
Bischoff-Ferrari HA, Giovannucci E, Willett WC, et al.
Estimation of optimal serum concentrations of
25-hydroxyvitamin D for multiple health outcome.
Am J Clin Nutr. 2006;84:18-28.
5 Bischoff-Ferrari HA, Shao A, Dawson-Hughes
B. et al. Benefit-risk assessment of vitamin D
supplementation. Osteoporosis Int. 2010;21:1121-32.
6 Standing Committee of European Doctors (CPME).
Vitamin D nutritional policy in Europe 2009.
7
www.restek.com/Technical-Resources/TechnicalLibrary/Clinical-Forensic-Toxicology/forensics_A015
8 http://www.chem.agilent .com/Library/
applications/5990-4549en_lo%20CMS.pdf
9 http://www.chem-agilent.com/cimg/ASMS2009-01_
Automated_SPE-LCMSMS_Assay.pdf
10 http://acgpubs.org/JCM/2007/Volume%201/
Issue%201/vitaminD_JCM-01.pdf
11 Zoë Maunsell, Dennis J. Wright, and Sandra
J. Rainbow; Routine Isotope-Dilution Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Assy
for Simultaneous Measurement of the 25-Hydroxy
Metabolites of Vitamins D2 and D3;Clinical
Chemistry 51:9 000-000 (2005).
48