BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De l’éprouvette au produit final PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010 La totalité.
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BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De l’éprouvette au produit final PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010 La totalité du matériel présenté est disponible à l’adresse web: http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/ Définition et contexte Biotechnologie: l’application de la science et de la technologie aux organismes vivants, à d’autres matériaux vivants ou non vivants, pour la production de savoir, biens et services. (source: OCDE) Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes sélectionnés pour produire des agents d’intérêt; Isolation d'agents à partir de sources biologiques. Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes modifiés, directement ou non, pour produire des agents d’intérêt. Les médicaments d'origine biologique Traditionnels: D'origine animale: produits sanguins, hormones, stéroïdes, catécholamines, prostaglandines, anticorps, insuline, vaccins… D'origine végétale: alcaloïdes, flavonoïdes, méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides cardiotoniques et coumarines, ac salicylique… D'origine microbienne: antibiotiques, enzymes, protéases, vaccins, … D'origine virale: vaccins Les médicaments d'origine biologique (suite) Biopharmaceutique: substance utilisée à des fins thérapeutiques ou diagnostiques, à base d'acides nucléiques ou de protéines, produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une source biologique non-modifiée. Exemples: Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX) Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogène) Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc) Facteurs de croissance (cytokines, interférons (IFN), interleukines (IL), érythropoïétine (EPO), facteur de croissance des colonies, …) Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de surface de l'hépatite B, …) Anticorps monoclonaux Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux, microARN, ARNi, …) Seulement 12% des nouveaux médicaments sont produits par synthèse/extraction 35% 34% 30% 25% 21% 20% 22% % 15% 12% 12% 10% 5% 0% Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapie génique % de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001) Plan Cibles Sources Produits/caractérisques Méthodes analytiques Développement de systèmes de production Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation Cibles des biopharmaceutiques DIAGNOSTIC/THÉRAPIE ADN ARN Dépistage/ thérapie génique Transcriptome/ ARNi traduction PROTÉINE Francis Crick, 1958 (source: NCBI) Protéome/ Anticorps, hormones… Syst immunitaire/vaccin Métabolisme/ Thérapie cellulaire Sources de biopharmaceutiques Virus Bactéries Levures Moisissures Cellules animales Invertébrés Mammifères Primates non-humains Humaines Lignées établies Cultures primaires Cellules souches Les virus Vaccins ou vecteurs de thérapie génique Influenza Vaccins - exemples: • Influenza (GSK) • Adénovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma pour DoD, 105-106 doses • Aussi: variole, rubéole, rougeole, oreillons, varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune, encéphalite japonaise, cancer, etc Herpes Adenovirus Maladies traitées par thérapie génique Vecteurs utilisés Type de gènes employés Phases cliniques La thérapie génique Rétrovirus Adénovirus La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche. Adénovirus: cycle d’infection Adénovirus: les gènes B Massie, IRB Adénovirus: évolution des vecteurs B Massie, IRB Adénovirus: construction R. Gilbert, IRB Adénovirus: production et utilisation B Massie, IRB Rétrovirus - Rétrovirus s’insère dans le génome de la cellule hôte - 3 familles de gènes: gag = capside, pol = polymérase, env = enveloppe - On manipule la protéine d’enveloppe pour altérer le tropisme du virus Rétrovirus: cycle de réplication Rétrovirus: construction de lignée de production Les autres outils génétiques Diagnostic Patron de digestion par enzymes de restriction Séquençage Hybridation FISH Gene chip qRT-PCR Autres phénomènes Épigénétique ARNi Techniques analytiques: L’identification de séquences d'ADN Tiré de Microbiology 101, WSU La digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction, suivi d'une électrophorèse permet une identification par la différence de taille des fragments L’identification de séquences (suite) En réalisant des PCR sur des fragments d'ADN en présence de désoxynucléotides et une alternance de didésoxynucléotides, on parvient à complètement séquencer l'ADN Hybridation fluorescente in situ (FISH) LE FISH est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie. Ces sondes peuvent être utilisées sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde ADN), ou sur des protéines (sonde anticorps). Le FISH est une technique de cytogénétique permettant de voir des éléments à l'intérieur de la cellule. L'expression des gènes: les biopuces 1- Comparaison de l’expression génétique de 2 échantillons cellulaires 2- Extraction de l ’ARN 3- Réverse transcription avec des nucléotides marqués par des fluorochromes différents 4- Hybridation compétitive sur des lamelles contenant des milliers d’oligonucléotides différents connus 5- Lecture des lamelles 6- Analyse des résultats Les biopuces (suite) Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes (cliquez sur les images pour une explication détaillée). quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR) Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR) Épigénétique • Le terme épigénétique définit les modifications transmissibles et réversibles de l'expression des gènes ne s'accompagnant pas de changements des séquences nucléotidiques. Les changements peuvent se produire spontanément, en réponse à l'environnement, à la présence d'un allèle particulier, même si celui-ci n'est plus présent dans les descendants • Certains caractères épigénétiques hérités pouvaient être transmis lors de la réplication cellulaire (méiose), voire subsister d'une génération à l'autre pour des organismes multicellulaires. • Les phénomènes épigénétiques constituent un programme qui déciderait quels gènes activer ou inhiber. L’environnement influence ces signaux épigénétiques qui peuvent ainsi subir de petits changements. Ces épimutations sont plus fréquentes que les mutations classiques de l’ADN. Phénomènes épigénétiques •Paramutations •Bookmarking •Imprinting •Gene silencing •X chromosome inactivation •Position effect •Reprogramming •Transvection •Effet maternel L’ARN anti-sens, interférent, micro-ARN (Pour plus de détails, cliquez ici) Exemple 1: Infectio Diagnostic Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD) Diagnostics à Québec: Identification génétique de bactéries pathogènes, de gènes de toxines et de gènes de résistance (Strep B, SARM, …) Basé sur la sensibilité, la spécificité et l'ubiquité de l'amorce PCR Temps du test ≈1 hr Exemple 2: Diagnocure La plate-forme technologique PCA3, un gène dont l'ARN messager est détecté dans la majorité des cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN messager n'est exprimé qu'à un très faible niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir de marqueur tumoral et les molécules dérivées de sa séquence, ARN messager ou peptide, peuvent servir à la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thérapie. La découverte du gène PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Université de Nijmegen et DiagnoCure détient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique. La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la détection d'acides nucléiques et de séquences de gènes spécifiques au cancer. Les produits dérivés de cette plate-forme technologique contiennent trois trousses utilisées selon un protocole en trois phases. Une trousse contient des billes de silice pour la purification des acides nucléiques de la préparation cellulaire analysée. Une autre trousse contient des amorces, des séquences d'acides nucléiques spécifiques au cancer investigué, et les réactifs nécessaires à l'amplification isothermique des ARNs messagers isolés avec la première trousse et complémentaires aux amorces fournies. La troisième trousse sert à la détection immunoenzymatique du produit amplifié. Cette plate-forme technologique peut donc servir à la mise au point de trousses de détection de tout cancer pour lequel on connaît une séquence spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon Teknika, DiagnoCure détient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous les cancers. Les protéines recombinantes (PR) 1ère: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly) 73 sur le marché en 2004, >80 en essais cliniques Croissance de 65% entre 2004 et 2010 (52G$/2010) Insuline+EPO+IFN = 57% du marché Protéines glycosylées = 60% du marché des PR, principalement mAb Les anticorps Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène Anticorps monoclonaux - applications 37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques Identification/diagnostic Thérapeutique: Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,... Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire. Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet. Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna) Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des micro-organismes. Les cellules thérapeutiques Cellules du sang: cellules souches hématopoïétiques, Lymphocytes, Mégakaryocytes, plaquettes (Hema-Québec) Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL) Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du SaintSacrement, LOEX) Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau canadien sur les cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le traitement du diabète, la maladie de Parkinson, l'insuffisance cardiaque, la dystrophie musculaire, la cécité, etc Les cellules souches hématopoïétiques Les cellules souches embryonnaires Les cellules souches adultes Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) • Prévalence: 1 garçon/3500 • Espérance de vie ≈ 20 ans Thérapie cellulaire de la DMD Essais cliniques phase 1 3x1010 cellules/kg à traiter Équivalent: 100g muscle donneur /kg à traiter Multiplication in vitro incontournable Volumes de culture: 30L/kg à traiter Prérequis: Milieu de culture efficace et sécuritaire Bioprocédé à grande échelle (en développement) Caractéristiques des protéines: épissage Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of nine interferon-a subtypes produced by Sendai virus induced human peripheral blood leucocytes". Biochem J, 329:295-302. Source: U Miami, cours BIL150 Caractéristiques des protéines: structure Thèse PhD, François GUILLONNEAU, 2002 Caractéristiques des protéines: les modifications post-traductionnelles •Clivage •Pont S •méthylation, phosphorylation, glycosilation •conformation •ajout de ligands spécifiques (lipid anchor) Tiré de PHK Analyses protéique et cellulaire Analyse de protéines activité ELISA Électrophorèse 1D, 2D, capillaire Chromatographie liquide (HPLC) Spectrométrie de masse Analyse cellulaire: Immuno-histo-chimie Cytométrie en flux Imagerie cellulaire en temps réel Systèmes robotisés Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Électrophorèse sur gel SDS-PAGE Transfert sur membrane de nitrocellulose et révélation avec marqueur spécifique: Western: EP + anticorps spécifiques à protéines Southern: EP + ADN marqué Northern: EP + ARN marqué Électrophorèse SDS-PAGE Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2. Fractionation of purified retroviral vector preparations by 1D Gel Electrophoresis Purified virus preparations with (a) and without (b) subtilisin treatment were fractionated on a 4-12% Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run under reducing conditions and visualized by silver staining. Protein bands from gel b were excised and subjected to ingel tryptic digestion prior to MS/MS analysis. Bands containing statistically significant peptide identifications (A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the protein profiles of samples a (green) and b (blue) superimposed. The theoretical migration positions of all MoMLV viral-encoded proteins are indicated in figure c. Gel d’électrophorèse 2-D (Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000) High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) •Échange d’ions •Tamis moléculaire •Interaction hydrophobe •Phase inverse •Électrophorèse •Automatique •Réfrigéré Échantilloneur Réservoir de Phase mobile Pompe Colonne Échantillon •En fonction de la colonne •Gradient •UV/visible •Fluorescence •Infra-rouge •Indice de réfraction •Conductivité •Spectrométrie de masse Détecteur Collecteur de fraction Hydrolysat trypsique de la BSA Spectrométrie de masse (MS) - interface L'électro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI) "Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn MS – domaines d'application L'électro-atomisation à pression atmosphérique (API-electrospray) permet l'analyse de protéines MS - analyseurs Constitué de: 1) une source d'ionisation 2) un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z 3) un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal 4) un système informatique pour traiter le signal Secteur magnétique MS - Quadrupole m/z 10-4000 Précision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000 m/z par sec Le temps de vie d’un ion de sa formation à sa détection ~40100 μs. www.bris.ac.uk MS - Temps d’envol (TOF) L’incorporation d’un réflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994; Cotter et al., 2004) TOF est communément employé avec MALDI, il peut aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et Whitehouse, 1992) www.chemistry.adelaide.edu.au LCMS – exemple d'appareil Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole MS – exemple de résultat •Myoglobine, MM= 16951 Da •Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonnée •Le spectre est le résultat de la distribution de charges sur la population moléculaire •Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protéine d'intérêt Analyse de protéines par MSMS Nomenclature de la dissociation en fragments proposée par Roepstorff, 1984 MS spectrum m/z MS/MS ion spectrum m/z (Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002) Exemple d'analyse MSMS Albumine Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisée en milieu de culture de cellules de mammifères Exemple d'analyse MSMS Albumine >P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77 Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org) Albumine: fragments trypsiques position mass peptide sequence position mass peptide sequence 25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK 29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK 37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK 45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR 76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR 89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK 101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK 106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK 118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR 131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR 139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER 157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR 161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK 184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR 198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK 223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK 229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK 236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK 249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK 281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA 286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK NYQEAK QNCDQFEK LCVLHEK RPCFSALTPDETYVPK AFDEK TVMENFVAFVDK CCAADDK Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique ANALYSE MS2, cliquez ici Identification de protéine, cliquez ici (Logiciel Mascot, Matrix Science) Protéomique du sérum sanguin •60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003) •10 000 protéines différentes •22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005) •12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005) •325 protéines identifiées en 2003 (Pieper et al., Proteomics, 3: 1345-1364) •3020 protéines identifiées en 2005 (Omenn et al., Proteomics, 5:…) Tirumalai et al., 2003 Protéomique du sérum sanguin Anderson et Anderson, 2002 Analyse cellulaire Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqué par une modification du champ électrique établi au travers d’un orifice au travers duquel un fluide contenant les particules est aspiré. Ce signal est proportionnel au volume des particules. Exemple: distribution de tailles de particules pour deux échantillons différents Immuno-histo-chimie Technique utilisant des anticorps spécifiques liés à des fluorochromes pour mettre en évidence une protéine présente sur une cellule ou un tissu. L'échantillon est par la suite observé en microscopie à fluorescence Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules Vero, Olympus Cytométrie en flux Technique permettant d'analyser des cellules à grande vitesse en les faisant passer une à une dans le faisceau d'un laser. La lumière ré-émise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier. En anglais: Flow cytometry ou Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) Exemple de cytométrie en flux Imagerie cellulaire en temps réel Chambre thermostatée, humidifiée et à concentration en CO2 controlée, montée sur la platine du microscope Exemple: suivi de la division et de la polyploïdisation de cellules mégakaryocytaires sur 12 hrs (cliquez ici) Sytèmes robotisés Composés: D'unités de gestion des liquides (Liquid handling stations) De bras robotisés D'incubateurs automatisés De lecteurs (Système Xiril, cliquez ici) Développement de systèmes de production Établissement de lignées cellulaires Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation Types de cellules animales Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC). Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions). Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée. Différentes lignées MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S) Exemple: historique du développement de la lignée HEK-293 Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977 La construction d'un système d'expression – transformation/transfection/transduction • Introduction d'ADN exogène sous la forme d'un plasmide dans des cellules procaryotes (transformation) ou eucaryotes (transfection) • Les cellules manipulées pour accepter un ADN étranger sont dites compétentes • Différentes méthodes: • Phosphate de Calcium • Liposomes • Polycations (ex: polyéthylène imine, PEI; DEAE-Dextran) • Électroporation • Gene gun • Transduction: introduction d'ADN exogène par le biais d'un virus (procaryote) •STABLE OU TRANSITOIRE Access Excellence La cassette d'expression • Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences contrôlant leur expression • Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T, etc; tissu spécifique) • Phase ouverte de lecture (Open reading frame) • Séquence de polyadénylation (PolyA) • Transactivateurs • Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, …) Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent être intercalés entre plusieurs ORFs Autre exemple: la co-transfection d’un plasmide et d’un adénovirus dans la lignée cellulaire 293 pour produire un adénovirus recombinant: B. Massie, IRB Sélection (Screening) • Commencer par une expression transitoire • Sélectionner en fonction: • Résistance à l'agent de sélection • Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la protéine d'intérêt • La stabilité de l'expression • La qualité du produit (analyse crystalographique, RMN, MS, patrons de glycosylation, activité, stabilité, pharmacocinétique) Les systèmes d’expression Bactéries (1-3 um) Levures Fungi Cellules animales (10-20 um) • Modifications posttraductionnelles + poussées • Produit plus stable • Milieu de culture + complexe • + grande fragilité des cellules • Coûts + élevés • Produits à + haute valeur ajoutée Critère de sélection: choisir le système le plus simple qui va faire le travail! Exemple de milieu de culture de cellules de mammifères: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) Sels (mg/L) CaCl2 Fe(NO3)3.9H2O KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4.H2O 200.00 0.10 400.00 97.67 6400.00 3700.00 125.00 Acides aminés (mg/L) Arginine Cystine.2HCl Glutamine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine.HCl Méthionine Phenylalanine Sérine 84.00 63.00 584.00 30.00 42.00 105.00 105.00 146.00 30.00 66.00 42.00 30.00 66.00 42.00 95.00 16.00 104.00 94.00 Vitamines (mg/L) Méthionine Phenylalanine Serine Thréonine Tryptophane Tyrosine.2Na.2H2O Valine Ca.pantothénate Chlorure de choline Acide folique Inositol Niacinamide Riboflavine Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl 4.00 4.00 4.00 7.20 4.00 0.40 4.00 4.00 Autres (mg/L) Glucose Rouge de phénol Na.Pyruvate 4500.00 15.00 110.00 + composants non-définis: sérum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc. Comparaison des différents systèmes d’expression X (densité cellulaire) Bactéries 5-50 gMS/L Cellules animales 1-50 x106 cells/mL (≈0,2-10 gMS/L) Oxygen Vitesse respiration rate d’agitation (OUR, mM/L) 50-500 500-700 rpm 0.1-10 20-120 rpm Coût du milieu 1-5$/L 25-1500$/L Difficulté supplémentaire Temps de division augmente avec la taille: Les cellules animales nécessitent des conditions d’asepsie très strictes Adhésion obligatoire: Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un support pour être viables. Cela: pose un problème de mise à l ’échelle les rend particulièrement susceptibles au cisaillement Ex: tapis cellulaire de myoblastes Culture sur microporteurs Exemple: Culture de myoblastes - test de différents microporteurs Comparaison de différents types de microporteurs # cellules/ml 2,00E+06 Cytodex 1 1,50E+06 Cytodex 3 1,00E+06 Texcel Autosuture 5,00E+05 0,00E+00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Temps (jour) Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74. 1.0 6 Myoblast density [x 10 cells/mL] Culture de myoblastes - transfert de particule à particule 0.5 100-mL spinner flasks 500-mL spinner flasks 0.0 0 5 10 Time [d] Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74. La production Le bioréacteur Les paramètres Les cinétiques de croissance des micro-organismes et de production Les modes de production Bioréacteurs Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB, U. Laval) Gracieuseté B.Braun Bioréaction: les paramètres Température pH composition du milieu Agitation Aération Asepsie Contrôle des paramètres p H F O 2 N 2 CO2 T O Air pH 2 Lecture T RPM Contrôle Optimisation des paramètres Effet de la température sur la production d’adénovirus recombinant en 293S 100 80 Relative titer 60 40 20 0 0 20 40 60 80 time (hpi) T=32°C Jardon et Garnier, 2000 T=35°C T=37°C T=39°C Les cinétiques de croissance et de production Le modèle le plus simple: dX X dt S MAX Ks S dS X dt Yx / s (bilan sur les cellules) dP dX X dt dt (modèle de Luedeking-Piret pour le produit) (cinétique de Monod) (bilan sur le substrat) K S YX / S X MAX X K S YX / S ( X MAX X ) MAX t ln ln X X X ( X X ) MAX 0 MAX MAX 0 P P0 MAX La solution X X X X 0 X X 0 K S Yx / s ln MAX X X 0 MAX X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit d’intérêt; : taux spécifique de croissance; max et Ks: paramètres de l ’expression de Monod; Yx/s: coefficient de rendement cellule/substrat; , : coefficient de la relation de Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S0+X0. Simulation à partir d’un modèle simple concentration (g/L) X, S et P vs t 25 20 15 10 5 0 X S P 0 2 4 6 8 temps (h) Cuvée, MAX = 1,16h-1, KS = 4 g/L, YX/S = 0,5 g/g, = 0,4 g/g, = g/(g.h) Autres cinétiques Inhibition par le substrat: 2 S KS S Ki Inhibition par le produit: MAX S ... MAX S K S S 1 P Ki Les modes d’opération Cuvée (batch) Cuvée-alimentée (fedbatch) Chemostat X, P filtrat Perfusion Culture en perfusion Relative Fluorescence Unit [ RFU ] 1000 800 600 400 200 0 0 20 40 60 80 Time [ hpi ] Figure 4. Fluorescence of 293S cells during infection with adenovirus: , Control; , B1 Perfusion 35oC; , B2 Perfusion 35oC; , B3 Perfusion 37oC; X, T-flask. Cortin et al., 2002 Le traitement en aval (downstream processing) Les étapes séparation homogénéisation concentration purification Séparation/Clarification Objectif: séparer les cellules du surnageant et conserver la fraction d’intérêt selon que le produit est intracellulaire ou extracellulaire Les méthodes usuelles: centrifugation micro-filtration (0,1-0,45 um) Filtres à fibres creuses (AG tech) Grande échelle = filtration tangentielle Principe de centrifugation en continu Homogénéisation Objectif: briser les cellules pour récupérer un produit intra-cellulaire Moyen: Gel/dégel Ultrason contraintes (stress) hydrodynamiques Concentration Objectif: réduire le volume Moyens: Précipitation Ultra-centrifugation Ultra-filtration (5kDa - 500kDa) AG technologies Purification Objectif: Isoler le produit d’intérêt Moyen: chromatographie Access Excellence Purification (suite) 3 types de chromatographie: Access Excellence Le contrôle de qualité Les molécules biopharmaceutiques sont soumises aux mêmes normes que la fabrication de molécules de synthèse: Bonnes pratiques de fabrication (GMP) Protocoles d’opération normalisés (SOP) Validation des procédés Documentation Ces normes sont appliquées de façon encore plus stricte pour les produits biologiques étant donné que les réactions menant à la formation du produit (le métabolisme cellulaire) ne sont pas bien définies. Le contrôle de qualité (suite) Toute une série de normes, lignes directrices et de «points à considérer » sont émis par le « Center for Biologics Evaluation and Research » (CBER) de la Food &Drug Administration » (FDA) http://www.fda.gov/cber/ Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal Regulations" (CFR) "Guidelines" et "point to consider » particulièrement pertinents: "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy" "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative Infectious Disease Indications" A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissuebased Products Le contrôle de qualité (suite) Classent le processus de production GMP en 7 catégories: Installation Équipement Personnel Matériels Protocoles Tests Documentation