BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De l’éprouvette au produit final PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010 La totalité.
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Transcript BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De l’éprouvette au produit final PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010 La totalité.
BIOTECHNOLOGIE
PHARMACEUTIQUE
De l’éprouvette au produit final
PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II
Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie
chimique, PROTEO, Hiver 2010
La totalité du matériel présenté est disponible à l’adresse web:
http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/
Définition et contexte
Biotechnologie: l’application de la science et de la
technologie aux organismes vivants, à d’autres
matériaux vivants ou non vivants, pour la production
de savoir, biens et services. (source: OCDE)
Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et
d’enzymes sélectionnés pour produire des agents
d’intérêt; Isolation d'agents à partir de sources
biologiques.
Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et
d’enzymes modifiés, directement ou non, pour
produire des agents d’intérêt.
Les médicaments d'origine biologique
Traditionnels:
D'origine animale: produits sanguins, hormones,
stéroïdes, catécholamines, prostaglandines,
anticorps, insuline, vaccins…
D'origine végétale: alcaloïdes, flavonoïdes,
méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides
cardiotoniques et coumarines, ac salicylique…
D'origine microbienne: antibiotiques, enzymes,
protéases, vaccins, …
D'origine virale: vaccins
Les médicaments d'origine biologique (suite)
Biopharmaceutique: substance utilisée à des fins thérapeutiques
ou diagnostiques, à base d'acides nucléiques ou de protéines,
produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une
source biologique non-modifiée.
Exemples:
Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX)
Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogène)
Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc)
Facteurs de croissance (cytokines, interférons (IFN), interleukines
(IL), érythropoïétine (EPO), facteur de croissance des colonies, …)
Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de surface de
l'hépatite B, …)
Anticorps monoclonaux
Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux,
microARN, ARNi, …)
Seulement 12% des nouveaux médicaments
sont produits par synthèse/extraction
35%
34%
30%
25%
21%
20%
22%
%
15%
12%
12%
10%
5%
0%
Cell. Mam.
Microbe
Vaccins
Extr/Synthèse
Thérapie
génique
% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
Plan
Cibles
Sources
Produits/caractérisques
Méthodes analytiques
Développement de systèmes de production
Construction/sélection
Procédés de production
Procédés de séparation
Cibles des biopharmaceutiques
DIAGNOSTIC/THÉRAPIE
ADN
ARN
Dépistage/
thérapie génique
Transcriptome/
ARNi
traduction
PROTÉINE
Francis Crick, 1958 (source: NCBI)
Protéome/
Anticorps,
hormones…
Syst immunitaire/vaccin
Métabolisme/ Thérapie cellulaire
Sources de biopharmaceutiques
Virus
Bactéries
Levures
Moisissures
Cellules animales
Invertébrés
Mammifères
Primates non-humains
Humaines
Lignées établies
Cultures primaires
Cellules souches
Les virus
Vaccins ou vecteurs de
thérapie génique
Influenza
Vaccins - exemples:
• Influenza (GSK)
• Adénovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma
pour DoD, 105-106 doses
• Aussi: variole, rubéole, rougeole, oreillons,
varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune,
encéphalite japonaise, cancer, etc
Herpes
Adenovirus
Maladies traitées par thérapie génique
Vecteurs utilisés
Type de gènes employés
Phases cliniques
La thérapie génique
Rétrovirus
Adénovirus
La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel
génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.
Adénovirus: cycle d’infection
Adénovirus: les gènes
B Massie, IRB
Adénovirus: évolution des vecteurs
B Massie, IRB
Adénovirus: construction
R. Gilbert, IRB
Adénovirus: production et utilisation
B Massie, IRB
Rétrovirus
- Rétrovirus s’insère dans le génome de la cellule hôte
- 3 familles de gènes: gag = capside, pol = polymérase, env = enveloppe
- On manipule la protéine d’enveloppe pour altérer le tropisme du virus
Rétrovirus: cycle de réplication
Rétrovirus: construction de lignée
de production
Les autres outils génétiques
Diagnostic
Patron de digestion par enzymes de restriction
Séquençage
Hybridation
FISH
Gene chip
qRT-PCR
Autres phénomènes
Épigénétique
ARNi
Techniques analytiques:
L’identification de séquences d'ADN
Tiré de Microbiology 101, WSU
La digestion de l'ADN avec des enzymes de
restriction, suivi d'une électrophorèse permet une
identification par la différence de taille des
fragments
L’identification de séquences (suite)
En réalisant des PCR sur des
fragments d'ADN en
présence de
désoxynucléotides et une
alternance de
didésoxynucléotides, on
parvient à complètement
séquencer l'ADN
Hybridation fluorescente in situ (FISH)
LE FISH est une technique de
biologie moléculaire d'hybridation in
situ utilisant des sondes marquées à
l'aide d'un marqueur fluorescent et
utilisées sur des coupes en
microscopie.
Ces sondes peuvent être utilisées
sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde
ADN), ou sur des protéines (sonde
anticorps). Le FISH est une
technique de cytogénétique
permettant de voir des éléments à
l'intérieur de la cellule.
L'expression des gènes: les biopuces
1- Comparaison de l’expression
génétique de 2 échantillons
cellulaires
2- Extraction de l ’ARN
3- Réverse transcription avec des
nucléotides marqués par des
fluorochromes différents
4- Hybridation compétitive sur des
lamelles contenant des milliers
d’oligonucléotides différents
connus
5- Lecture des lamelles
6- Analyse des résultats
Les biopuces (suite)
Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes (cliquez sur les images
pour une explication détaillée).
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
Épigénétique
• Le terme épigénétique définit les modifications
transmissibles et réversibles de l'expression des gènes ne
s'accompagnant pas de changements des séquences
nucléotidiques. Les changements peuvent se produire
spontanément, en réponse à l'environnement, à la
présence d'un allèle particulier, même si celui-ci n'est plus
présent dans les descendants
• Certains caractères épigénétiques hérités pouvaient être
transmis lors de la réplication cellulaire (méiose), voire
subsister d'une génération à l'autre pour des organismes
multicellulaires.
• Les phénomènes épigénétiques constituent un
programme qui déciderait quels gènes activer ou inhiber.
L’environnement influence ces signaux épigénétiques qui
peuvent ainsi subir de petits changements. Ces
épimutations sont plus fréquentes que les mutations
classiques de l’ADN.
Phénomènes
épigénétiques
•Paramutations
•Bookmarking
•Imprinting
•Gene silencing
•X chromosome
inactivation
•Position effect
•Reprogramming
•Transvection
•Effet maternel
L’ARN anti-sens, interférent, micro-ARN
(Pour plus de détails, cliquez ici)
Exemple 1: Infectio Diagnostic
Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm
Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD)
Diagnostics à Québec:
Identification génétique de bactéries pathogènes,
de gènes de toxines et de gènes de résistance
(Strep B, SARM, …)
Basé sur la sensibilité, la spécificité et l'ubiquité de
l'amorce PCR
Temps du test ≈1 hr
Exemple 2: Diagnocure
La plate-forme technologique PCA3, un gène dont l'ARN messager est détecté dans la majorité des
cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN messager n'est exprimé qu'à un très faible
niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir
de marqueur tumoral et les molécules dérivées de sa séquence, ARN messager ou peptide,
peuvent servir à la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thérapie. La découverte
du gène PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Université de Nijmegen et
DiagnoCure détient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique.
La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la détection d'acides nucléiques
et de séquences de gènes spécifiques au cancer. Les produits dérivés de cette plate-forme
technologique contiennent trois trousses utilisées selon un protocole en trois phases. Une trousse
contient des billes de silice pour la purification des acides nucléiques de la préparation cellulaire
analysée. Une autre trousse contient des amorces, des séquences d'acides nucléiques spécifiques
au cancer investigué, et les réactifs nécessaires à l'amplification isothermique des ARNs
messagers isolés avec la première trousse et complémentaires aux amorces fournies. La
troisième trousse sert à la détection immunoenzymatique du produit amplifié. Cette plate-forme
technologique peut donc servir à la mise au point de trousses de détection de tout cancer pour
lequel on connaît une séquence spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon
Teknika, DiagnoCure détient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous
les cancers.
Les protéines recombinantes (PR)
1ère: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly)
73 sur le marché en 2004, >80 en essais
cliniques
Croissance de 65% entre 2004 et 2010
(52G$/2010)
Insuline+EPO+IFN = 57% du marché
Protéines glycosylées = 60% du marché des
PR, principalement mAb
Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec
un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de
polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa
(chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de
l’anticorps pour son antigène
Anticorps monoclonaux - applications
37% des nouvelles molécules thérapeutiques
biologiques
Identification/diagnostic
Thérapeutique:
Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,...
Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent
bloquer une interaction récepteur-ligand ou
déclencher une réponse immunitaire.
Ils peuvent aussi être liés à un agent
chemothérapeutique, radioactif ou autre pour
augmenter leur effet.
Exemple: Agent anti-angiogénétique
(Laboratoires Aeterna)
Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux
vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la
tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce
processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron
de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes
responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des
micro-organismes.
Les cellules thérapeutiques
Cellules du sang: cellules souches hématopoïétiques, Lymphocytes,
Mégakaryocytes, plaquettes (Hema-Québec)
Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL)
Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du SaintSacrement, LOEX)
Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau canadien sur les
cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le
traitement du diabète, la maladie de Parkinson, l'insuffisance
cardiaque, la dystrophie musculaire, la cécité, etc
Les cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches embryonnaires
Les cellules souches adultes
Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)
• Prévalence: 1 garçon/3500
• Espérance de vie ≈ 20 ans
Thérapie cellulaire de la DMD
Essais cliniques phase 1
3x1010 cellules/kg à traiter
Équivalent: 100g muscle donneur /kg à
traiter
Multiplication in vitro incontournable
Volumes de culture: 30L/kg à traiter
Prérequis:
Milieu de culture efficace et sécuritaire
Bioprocédé à grande échelle (en
développement)
Caractéristiques des protéines: épissage
Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of
nine interferon-a subtypes produced by Sendai
virus induced human peripheral blood
leucocytes". Biochem J, 329:295-302.
Source: U Miami, cours BIL150
Caractéristiques des protéines: structure
Thèse PhD, François
GUILLONNEAU, 2002
Caractéristiques des protéines: les
modifications post-traductionnelles
•Clivage
•Pont S
•méthylation, phosphorylation,
glycosilation
•conformation
•ajout de ligands spécifiques (lipid
anchor)
Tiré de PHK
Analyses protéique et cellulaire
Analyse de protéines
activité
ELISA
Électrophorèse 1D, 2D, capillaire
Chromatographie liquide (HPLC)
Spectrométrie de masse
Analyse cellulaire:
Immuno-histo-chimie
Cytométrie en flux
Imagerie cellulaire en temps réel
Systèmes robotisés
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Électrophorèse sur gel
SDS-PAGE
Transfert sur
membrane de
nitrocellulose et
révélation avec
marqueur spécifique:
Western: EP +
anticorps spécifiques
à protéines
Southern: EP + ADN
marqué
Northern: EP + ARN
marqué
Électrophorèse SDS-PAGE
Tiré de Segura, Garnier et al
(2007). Figure 2. Fractionation of
purified
retroviral
vector
preparations
by
1D
Gel
Electrophoresis
Purified virus preparations with (a) and
without (b) subtilisin treatment were
fractionated on a 4-12% Tris-Glycine
polyacrylamide gel (Invitrogen) run
under reducing conditions and visualized
by silver staining. Protein bands from
gel b were excised and subjected to ingel tryptic digestion prior to MS/MS
analysis. Bands containing statistically
significant peptide identifications (A-L)
are indicated on gel b. Figure 2c shows
the protein profiles of samples a (green)
and b (blue) superimposed. The
theoretical migration positions of all
MoMLV viral-encoded proteins are
indicated in figure c.
Gel d’électrophorèse 2-D
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
•Échange d’ions
•Tamis moléculaire
•Interaction hydrophobe
•Phase inverse
•Électrophorèse
•Automatique
•Réfrigéré
Échantilloneur
Réservoir de
Phase mobile
Pompe
Colonne
Échantillon
•En fonction
de la colonne
•Gradient
•UV/visible
•Fluorescence
•Infra-rouge
•Indice de réfraction
•Conductivité
•Spectrométrie de
masse
Détecteur
Collecteur de fraction
Hydrolysat trypsique de la BSA
Spectrométrie de masse (MS) - interface
L'électro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)
"Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn
MS – domaines d'application
L'électro-atomisation à pression atmosphérique (API-electrospray) permet l'analyse de protéines
MS - analyseurs
Constitué de:
1) une source d'ionisation
2) un ou plusieurs
analyseurs qui séparent
les ions produits selon
leur rapport m/z
3) un détecteur qui compte
les ions et amplifie le
signal
4) un système informatique
pour traiter le signal
Secteur magnétique
MS - Quadrupole
m/z 10-4000
Précision :~m/z 0.1-0.2
Vitesse de balayage: 5000 m/z
par sec
Le temps de vie d’un ion de sa
formation à sa détection ~40100 μs.
www.bris.ac.uk
MS - Temps d’envol (TOF)
L’incorporation d’un
réflectron dans le tube du
TOF ou une extraction
ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994;
Cotter et al., 2004)
TOF est communément
employé avec MALDI, il peut
aussi être utilisé avec un ESI
(Boyle et Whitehouse, 1992)
www.chemistry.adelaide.edu.au
LCMS – exemple d'appareil
Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole
MS – exemple de résultat
•Myoglobine, MM= 16951 Da
•Le résultat obtenu est un spectre
de masse représentant les rapports
m/z des ions détectés sur l'abscisse
et l'abondance relative de ces ions
sur l'ordonnée
•Le spectre est le résultat de la
distribution de charges sur la
population moléculaire
•Permet d'analyser qualitativement
et quantitativement la protéine
d'intérêt
Analyse de protéines par MSMS
Nomenclature de la dissociation en
fragments proposée par Roepstorff, 1984
MS spectrum
m/z
MS/MS ion
spectrum
m/z
(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisée en
milieu de culture de cellules de mammifères
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine).
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF
DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY
ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA
RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR
HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK
LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP
DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77
Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org)
Albumine: fragments trypsiques
position
mass
peptide sequence
position
mass
peptide sequence
25-28
500,2463
DTHK
300-309
1177,5591
ECCDKPLLEK
29-34
712,3736
SEIAHR
310-318
1015,4877
SHCIAEVEK
37-44
974,4577
DLGEEHFK
319-336
1955,9596
DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65
2435,2427
GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK
341-346
752,3573
66-75
1163,6306
LVNELTEFAK
347-359
1567,7427
DAFLGSFLYEYSR
76-88
1349,546
TCVADESHAGCEK
361-371
1283,7106
HPEYAVSVLLR
89-100
1362,6722
SLHTLFGDELCK
375-386
1388,5708
EYEATLEECCAK
101-105
545,3405
VASLR
387-399
1497,6314
DDPHACYSTVFDK
106-117
1364,4803
ETYGDMADCCEK
402-412
1305,7161
HLVDEPQNLIK
118-122
658,3155
QEPER
413-420
1011,42
123-130
977,4509
NECFLSHK
421-433
1479,7954
LGEYGFQNALIVR
131-138
886,4152
DDSPDLPK
438-451
1511,8427
VPQVSTPTLVEVSR
139-151
1519,7461
LKPDPNTLCDEFK
460-468
1052,4499
CCTKPESER
157-160
537,282
FWGK
469-482
1667,8131
MPCTEDYLSLILNR
161-167
927,4934
YLYEIAR
483-489
841,46
169-183
1888,9268
HPYFYAPELLYYANK
490-495
660,3563
TPVSEK
184-197
1633,6621
YNGVFQECCQAEDK
499-507
1024,455
CCTESLVNR
198-204
701,4014
GACLLPK
508-523
1823,8996
205-209
649,3338
IETMR
524-528
609,2878
212-218
703,4097
VLASSAR
529-544
1850,8993
LFTFHADICTLPDTEK
223-228
649,3338
CASIQK
549-557
1014,6193
QTALVELLK
229-232
508,2514
FGER
558-561
509,3194
HKPK
236-241
689,3729
AWSVAR
562-568
818,4254
ATEEQLK
249-256
922,488
AEFVEVTK
569-580
1399,6926
257-263
789,4716
LVTDLTK
581-587
725,2593
267-280
1578,5981
ECCHGDLLECADDR
588-597
1050,4924
EACFAVEGPK
281-285
517,298
ADLAK
598-607
1002,583
LVVSTQTALA
286-297
1386,6206
YICDNQDTISSK
NYQEAK
QNCDQFEK
LCVLHEK
RPCFSALTPDETYVPK
AFDEK
TVMENFVAFVDK
CCAADDK
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2,
cliquez ici
Identification de
protéine, cliquez ici
(Logiciel Mascot, Matrix Science)
Protéomique du sérum sanguin
•60 à 80 g/L de protéine
(Tirumalai et al., 2003)
•10 000 protéines différentes
•22 protéines = 99% de la
quantité protéinique du
sérum (Zhang et al., 2005)
•12 log de variation de
concentration (Anderson et
Anderson, 2002; Zhang et
al., 2005)
•325 protéines identifiées en
2003 (Pieper et al.,
Proteomics, 3: 1345-1364)
•3020 protéines identifiées en
2005 (Omenn et al.,
Proteomics, 5:…)
Tirumalai et al., 2003
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
Analyse cellulaire
Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqué par une
modification du champ électrique établi au travers d’un orifice au travers
duquel un fluide contenant les particules est aspiré. Ce signal est
proportionnel au volume des particules.
Exemple: distribution de tailles de particules
pour deux échantillons différents
Immuno-histo-chimie
Technique utilisant des
anticorps spécifiques liés à
des fluorochromes pour
mettre en évidence une
protéine présente sur une
cellule ou un tissu.
L'échantillon est par la suite
observé en microscopie à
fluorescence
Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules
Vero, Olympus
Cytométrie en flux
Technique permettant
d'analyser des cellules à
grande vitesse en les faisant
passer une à une dans le
faisceau d'un laser. La
lumière ré-émise (par
diffusion ou fluorescence)
permet de classer la
population suivant plusieurs
critères et de les trier.
En anglais: Flow cytometry
ou Fluorescence Assisted Cell
Sorting (FACS)
Exemple de cytométrie en flux
Imagerie cellulaire en temps réel
Chambre thermostatée,
humidifiée et à
concentration en CO2
controlée, montée sur la
platine du microscope
Exemple: suivi de la
division et de la
polyploïdisation de cellules
mégakaryocytaires sur 12
hrs (cliquez ici)
Sytèmes robotisés
Composés:
D'unités de gestion des liquides (Liquid
handling stations)
De bras robotisés
D'incubateurs automatisés
De lecteurs
(Système Xiril, cliquez ici)
Développement de systèmes de production
Établissement de lignées cellulaires
Construction/sélection
Procédés de production
Procédés de séparation
Types de cellules animales
Culture primaire: Culture initiale de cellules qui
viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée.
Généralement à attachement obligatoire (ADC).
Culture secondaire: Propagation d’une culture
primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être
cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée
de vie limitée (30-50 divisions).
Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée
de vie illimitée.
Différentes lignées
MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains,
adhérentes, vaccins
HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes,
recherche
CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension,
versatile
Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile
Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression
baculovirus
HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment
d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension
(293S)
Exemple: historique du développement de
la lignée HEK-293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977
La construction d'un système d'expression
– transformation/transfection/transduction
• Introduction d'ADN exogène sous la forme
d'un plasmide dans des cellules procaryotes
(transformation) ou eucaryotes (transfection)
•
Les cellules manipulées pour accepter un
ADN étranger sont dites compétentes
• Différentes méthodes:
• Phosphate de Calcium
• Liposomes
• Polycations (ex: polyéthylène imine,
PEI; DEAE-Dextran)
• Électroporation
• Gene gun
• Transduction: introduction d'ADN exogène
par le biais d'un virus (procaryote)
•STABLE OU TRANSITOIRE
Access Excellence
La cassette d'expression
• Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences
contrôlant leur expression
• Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T,
etc; tissu spécifique)
• Phase ouverte de lecture (Open reading frame)
• Séquence de polyadénylation (PolyA)
• Transactivateurs
• Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, …)
Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent être
intercalés entre plusieurs ORFs
Autre exemple: la co-transfection d’un plasmide et d’un
adénovirus dans la lignée cellulaire 293 pour produire un
adénovirus recombinant:
B. Massie, IRB
Sélection (Screening)
• Commencer par une expression transitoire
• Sélectionner en fonction:
• Résistance à l'agent de sélection
• Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la
protéine d'intérêt
• La stabilité de l'expression
• La qualité du produit (analyse crystalographique, RMN,
MS, patrons de glycosylation, activité, stabilité,
pharmacocinétique)
Les systèmes d’expression
Bactéries (1-3 um)
Levures
Fungi
Cellules animales
(10-20 um)
• Modifications posttraductionnelles + poussées
• Produit plus stable
• Milieu de culture +
complexe
• + grande fragilité des
cellules
• Coûts + élevés
• Produits à + haute valeur
ajoutée
Critère de sélection: choisir le système le plus
simple qui va faire le travail!
Exemple de milieu de culture de cellules de mammifères:
Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)
Sels (mg/L)
CaCl2
Fe(NO3)3.9H2O
KCl
MgSO4
NaCl
NaHCO3
NaH2PO4.H2O
200.00
0.10
400.00
97.67
6400.00
3700.00
125.00
Acides aminés (mg/L)
Arginine
Cystine.2HCl
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine.HCl
Méthionine
Phenylalanine
Sérine
84.00
63.00
584.00
30.00
42.00
105.00
105.00
146.00
30.00
66.00
42.00
30.00
66.00
42.00
95.00
16.00
104.00
94.00
Vitamines (mg/L)
Méthionine
Phenylalanine
Serine
Thréonine
Tryptophane
Tyrosine.2Na.2H2O
Valine
Ca.pantothénate
Chlorure de choline
Acide folique
Inositol
Niacinamide
Riboflavine
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
0.40
4.00
4.00
Autres (mg/L)
Glucose
Rouge de phénol
Na.Pyruvate
4500.00
15.00
110.00
+ composants non-définis: sérum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc.
Comparaison des différents
systèmes d’expression
X (densité
cellulaire)
Bactéries
5-50 gMS/L
Cellules
animales
1-50 x106
cells/mL
(≈0,2-10 gMS/L)
Oxygen
Vitesse
respiration rate d’agitation
(OUR, mM/L)
50-500
500-700 rpm
0.1-10
20-120 rpm
Coût du milieu
1-5$/L
25-1500$/L
Difficulté supplémentaire
Temps de division augmente avec la taille:
Les cellules animales nécessitent des conditions d’asepsie très
strictes
Adhésion obligatoire:
Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un
support pour être viables. Cela:
pose un problème de mise à l ’échelle
les rend particulièrement susceptibles au cisaillement
Ex: tapis cellulaire de myoblastes
Culture sur microporteurs
Exemple: Culture de myoblastes
- test de différents microporteurs
Comparaison de différents types de microporteurs
# cellules/ml
2,00E+06
Cytodex 1
1,50E+06
Cytodex 3
1,00E+06
Texcel
Autosuture
5,00E+05
0,00E+00
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Temps (jour)
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001),
"Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1):63-74.
1.0
6
Myoblast density [x 10 cells/mL]
Culture de myoblastes - transfert
de particule à particule
0.5
100-mL spinner flasks
500-mL spinner flasks
0.0
0
5
10
Time [d]
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001),
"Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1):63-74.
La production
Le bioréacteur
Les paramètres
Les cinétiques de croissance des
micro-organismes et de production
Les modes de production
Bioréacteurs
Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB, U. Laval)
Gracieuseté B.Braun
Bioréaction: les paramètres
Température
pH
composition du milieu
Agitation
Aération
Asepsie
Contrôle des paramètres
p
H
F
O
2
N
2
CO2
T
O
Air
pH
2
Lecture
T
RPM
Contrôle
Optimisation des paramètres
Effet de la température sur la production
d’adénovirus recombinant en 293S
100
80
Relative titer
60
40
20
0
0
20
40
60
80
time (hpi)
T=32°C
Jardon et Garnier, 2000
T=35°C
T=37°C
T=39°C
Les cinétiques de croissance et de
production
Le modèle le plus simple:
dX
X
dt
S
MAX
Ks S
dS
X
dt
Yx / s
(bilan sur les cellules)
dP
dX
X
dt
dt
(modèle de Luedeking-Piret pour le produit)
(cinétique de Monod)
(bilan sur le substrat)
K S YX / S X MAX X K S YX / S ( X MAX X )
MAX t
ln
ln
X
X
X
(
X
X
)
MAX
0
MAX
MAX
0
P P0
MAX
La solution
X
X
X X 0
X X 0 K S Yx / s ln MAX
X
X
0
MAX
X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit d’intérêt; : taux spécifique de
croissance; max et Ks: paramètres de l ’expression de Monod; Yx/s: coefficient de rendement cellule/substrat; , : coefficient de la
relation de Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S0+X0.
Simulation à partir d’un modèle simple
concentration (g/L)
X, S et P vs t
25
20
15
10
5
0
X
S
P
0
2
4
6
8
temps (h)
Cuvée, MAX = 1,16h-1, KS = 4 g/L, YX/S = 0,5 g/g, = 0,4 g/g, = g/(g.h)
Autres cinétiques
Inhibition par le substrat:
2
S
KS S
Ki
Inhibition par le produit:
MAX S
...
MAX S
K S S 1 P
Ki
Les modes d’opération
Cuvée (batch)
Cuvée-alimentée
(fedbatch)
Chemostat
X, P
filtrat
Perfusion
Culture en perfusion
Relative Fluorescence Unit
[ RFU ]
1000
800
600
400
200
0
0
20
40
60
80
Time [ hpi ]
Figure 4. Fluorescence of 293S cells during
infection with adenovirus: , Control; ,
B1 Perfusion 35oC; , B2 Perfusion 35oC; ,
B3 Perfusion 37oC; X, T-flask.
Cortin et al., 2002
Le traitement en aval (downstream processing)
Les étapes
séparation
homogénéisation
concentration
purification
Séparation/Clarification
Objectif: séparer les cellules du surnageant et conserver la
fraction d’intérêt selon que le produit est intracellulaire ou
extracellulaire
Les méthodes usuelles:
centrifugation
micro-filtration (0,1-0,45 um)
Filtres à fibres creuses (AG tech)
Grande échelle = filtration tangentielle
Principe de centrifugation en continu
Homogénéisation
Objectif: briser les cellules pour récupérer un
produit intra-cellulaire
Moyen:
Gel/dégel
Ultrason
contraintes (stress) hydrodynamiques
Concentration
Objectif: réduire le volume
Moyens:
Précipitation
Ultra-centrifugation
Ultra-filtration (5kDa - 500kDa)
AG technologies
Purification
Objectif: Isoler le
produit d’intérêt
Moyen:
chromatographie
Access Excellence
Purification (suite)
3 types de chromatographie:
Access Excellence
Le contrôle de qualité
Les molécules biopharmaceutiques sont soumises aux
mêmes normes que la fabrication de molécules de
synthèse:
Bonnes pratiques de fabrication (GMP)
Protocoles d’opération normalisés (SOP)
Validation des procédés
Documentation
Ces normes sont appliquées de façon encore plus stricte
pour les produits biologiques étant donné que les
réactions menant à la formation du produit (le
métabolisme cellulaire) ne sont pas bien définies.
Le contrôle de qualité (suite)
Toute une série de normes, lignes directrices et de «points à
considérer » sont émis par le « Center for Biologics Evaluation
and Research » (CBER) de la Food &Drug Administration »
(FDA) http://www.fda.gov/cber/
Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal
Regulations" (CFR)
"Guidelines" et "point to consider » particulièrement pertinents:
"Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy"
"Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative
Infectious Disease Indications"
A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissuebased Products
Le contrôle de qualité (suite)
Classent le processus de production GMP en 7
catégories:
Installation
Équipement
Personnel
Matériels
Protocoles
Tests
Documentation