Le cytosquelette I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III - Les moteurs.

Transcript Le cytosquelette I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III - Les moteurs.

Le cytosquelette

I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II Régulation des filaments du cytosquelette III Les moteurs moléculaires IV - Fonctions du cytosquelette dans la cellule

II Régulation des filaments du cytosquelette

Dynamisme des éléments du cytosquelette • Régulation des filaments en longueur, stabilité, nombre et géométrie • Interagissent les uns avec les autres et avec les autres composants de la cellule • Parfois liaisons covalentes de protéines accessoires – Soit avec les sous-unités – Soit avec le filament 3

Plan

Nucléation Protéines de liaison  cytosquelette dynamisme du Organisation d'ordre supérieur Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique 4

A – Nucléation

Nucléation des microtubules a)  -tubuline b) Centrosome 2.

c) Autres cas Nucléation des microfilaments 5

1 Nucléation des microtubules

• • C entre O rganisateur des M icro T ubules (COMT) = site de nucléation des microtubules dans la cellule  tubuline = nucléation des microtubules • De la levure à l'homme • • Présente dans tous les COMT  -tubuline ring complex (  TuRC) = COMT très puissant 6

a) Nucléation des microtubules par la



-tubuline

• Nucléation à l’extrémité moins • Allongement par l’extrémité plus • Intervention de deux protéines qui se fixent directement à la  -tubuline 7

• Nucléation d'un microtubule par  -TuRC

Fig16-22

• • Présence des deux protéines plus des protéines accessoires pour aider à la création de l’anneau  -tubuline ring complexes en microscopie électronique • MT nucléés à partir de  tubuline ring complexes purifiés 8

Modèles de nucléation des microtubules

Moritz,M2001(fig1)

Microtubule nucléé spontanément à partir de tubuline  /  pure Modèle avec matrice Modèle protofilament 9

Moritz,M2001(fi g2)

• Structure de  -tubuline ring complexes isolés de drosophile Dgrip Drosophila gamma ring protein 10

New models of microtubule nucleation by the  -TuRC or monomeric -tubulin

Moritz,M2001(fig4)

 TuSC :  -tubulin small complex Dgrip : Drosophila gamma ring protein 11

b) - Le centrosome : principal centre organisateur des microtubules

• Situé près du noyau • Émanation des microtubules en étoile à partir du centrosome • Extrémité - des MT dans le centrosome • Extrémité + des MT en périphérie • Contient plus de 50 copies de  -TuRC dans sa matrice • Contient une paire de centrioles 12

Le centrosome

Fig16-23

Les centrioles

• id corpuscules basaux des cils et des flagelles • Matériel péricentriolaire = matrice centrosomale • Duplication des centrioles suivie de la duplication des centrosomes • cf. mitose 14

Structure des centrioles

• Cylindre de microtubules + protéines accessoires 15

Fig16-24

• Un centriole dans un centrosome • Matrice centrosomale fibreuse 16

c) - Cas particuliers de COMT

• Champignons et diatomés – pas de centriole – plaques incluses dans l'enveloppe nucléaire : corps du pôle du fuseau • Plantes supérieures – pas de centriole – COMT répartis tout autour de l'enveloppe nucléaire • Présence de  -tubuline dans tous les cas 17

Orientation des microtubules

• Configuration en étoile des microtubules • Extrémité plus cellule tournée vers l’extérieur de la • Extrémité moins tournée vers le noyau • Dispositif de surveillance – de la périphérie de l’intérieur de la cellule – et de la position centrale du centrosome • conservé même

in vitro

… 18

Positionnement du centrosome au centre de la cellule Fig16-25

Centrosome isolé + tubuline dans une chambre artificielle en plastique (image toutes les 3 minutes) 19

Positionnement des COMTs dans des micro-chambres

•Positioning of MTOCs in microfabricated chambers. (a) Three differential interference contrast images of a centrosome in a square chamber. The chamber is 4 μm deep and the tubulin concentration is 3.2 mg/ml. Images are 3 min apart. The slope of the well dominates the signal close to the edges of the chamber. (b) Three fluorescence images of an AMTOC

Holy,TE1997

concentration is 1.4 mg/ml. Time is indicated in each frame. (c) An aster regrown from an AMTOC in 2.3 mg/ml tubulin, stabilized by diluting with 30% (vol/vol) glycerol/BRB80, spun down through a cushion of 40% glycerol/BRB80 onto a coverslip coated with 3-aminopropyltriethoxysilane, and fixed with glutaraldehyde. Image taken by confocal fluorescence microscopy. (d) Two centrosomes in a square chamber. (All bars are 10 μm.) 20

Mélanophore de poisson

Fig16-26

MT = point de repère dans la cellule

• Permet de retrouver le centre de la cellule • Permet de disposer les organites dans les cytosol • Propriété intrinsèque des microtubules 22

2 Nucléation des microfilaments (d'actine)

• (Nucléation des MT : près du noyau) • Nucléation des microfilaments : sur la membrane plasmique  accumulation de microfilaments en périphérie  définit le cortex cellulaire • Cortex cellulaire – Couche de filaments d’actine accumulés sous la membrane plasmique – Détermine la forme et le mouvement de la surface cellulaire  forme • 1-D : microvillosités, spicules, filopodes • 2-D : lamellipodes 23

Anciens filaments existant avant la perméabilisation Nouveaux filaments formés sur le bord avant: site de nucléation des filaments • Bord avant d’un fibroblaste : nucléation des MF • Incubation avec actine rhodamine visualisant les nouveaux filaments d’actine 24

• • • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts – MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513

Figure 2.

Symons,MH1991p503

(a-c) shows a detail of a cell simultaneously permeabilized and fixed 24 s after injection. –

(a)

Rhodamine stain, showing newly incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in (d).

– (b) Fluorescein- phalloidin stain, showing both preexisting and newly incorporated filaments; – (c) rhodamine/fluorescein ratio image, the arrowheads delineate the lamellipodium, and correspond to the fat arrows marked in the intensity profiles . The appearance of the stress fibers in the ratio image (c) as yellow over a red background, while they are not visible in the rhodamine image (a) itself, is caused by the higher background in the perinuclear part of the rhodamine image, which is divided by the stress fibers in the corresponding area of the fluorescein image (b) .

– (d) Not shown Normalized intensity profiles from the respective channels along the lines delineated by arrows in a. ( - ) Fluorescein profile; ( - - - -) rhodamine profile. The fat arrows in ddelineate the lamellipodium, the thin arrow indicates the front of the wave of incorporated actin. See Materials and Methods for further details. The color scale from green to purple corresponds to low and high rhodamine/fluorescein ratios, respectively.

– Bars, (b) 10 /,m; (d) 2 .5 Am.

Figure 4. Steady-state incorporationof injected actin, showing a detail of a cell fixed 20 min after injection.

– (a) Rhodamine stain, showing the incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in d.

– (b) Phalloidin stain .

– (c) Rhodamine/ fluorescein ratio image, arrowheads delineate the lamellipodium boundaries .

and dashed line, rhodamine profile. Fat arrows delineate the lamellipodium.

– Bars : (b) 10 um; (d) 2.5 gym.

Symons,MH1991p503

• • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts – MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513

Figure 5.

Rhodamine-actin incorporation in – (a) rhodamine stain, showing exogenous actin incorporation ; – (b) fluorescein-phalloidin stain, showing preexisting and newly incorporated filaments; 26

Mécanisme de la nucléation

• Régulée par des signaux externes • Catalysée par un complexe de protéines qui comprend deux Actine Related Proteins (ARPs) 27

Actin Related Proteins (ARPs)

• Catalysent la nucléation de l'actine • 2 protéines proche à 45% de l'actine • Fonction analogue à  -TuRC pour la tubuline • Comprend le complexe ARP (= Arp 2/3) • Nuclée le filament à partir de l’extrémité – • Et allonge rapidement l’extrémité + • Peut se fixer latéralement  embranchement 28

Rôle du complexe ARP dans la nucléation de l'actine

Fig16-28(AB)

Rôle du complexe ARP dans la formation du réseau d'actine

Fig16-28(C)

Microscopie électronique de complexes Arp2/3 en congélation sublimation et ombrage rotatoire (A) et de complexes mélangés avec des filaments d’actine cappés avec de la gelsoline (B-D).

Electron micrographs of quick-frozen, deep-etched, and rotary-shadowed samples of Arp2/3 complex

(A)

and complex mixed with gelsolin-capped actin filaments (B-D). In the presence of Arp2/3, complex actin filaments form branching arbors with numerous end-to-side connections between filaments

(B)

. The branch points appear to be rigid attachments with a fixed 70° angle between actin filaments

(C)

and frequently contain a globular mass at the point of attachment (

, left arrow in

(D)

Filaments partially decorated with Arp2/3 complex.

(E)

Globular masses associated with filament pointed ends in the presence of Arp2/3 complex.

Mullins,RD1998

Données évolutives  -tubuline et ARP • Très anciens • Très conservés • Duplication du gène codant pour tubuline ou actine avec une fonction de nucléation en plus par divergence et spécialisation 32

B – Protéines de liaison



dynamisme du cytosquelette

a) Protéines de liaison aux sous-unités libres Actine b) a)

ii.

Thymosine Profiline

Tubuline

Stathmine

Protéines de liaison latérale b)

Tubuline

MAPs i.

Actine

Tropomyosine

a) b)

ii.

Cofiline

Protéines de liaison aux extrémités Actine Tubuline 33

1 Protéines de liaison aux sous-unités libres a) Actine b) Tubuline 34

a) Actine

• Dans une cellule (non musculaire) : 50% actine filamenteuse / 50% actine soluble • [Actine] en monomère dans une cellule : 50-200  M (2-8 mg/ml) • C c [Actine] en monomère en tube à essai : <1  M  • Pourquoi l’actine soluble ne polymérise-t-elle pas en filaments dans la cellule ?

• Parce qu’il y a des protéines qui empêchent la polymérisation en se fixant sur les sous-unités 35

Protéines de liaison aux sous-unités libres d’actine

• Thymosine : la plus abondante • Profiline • Ne peuvent être fixées en même temps 36

Thymosine

• Bloque l'actine libre  • Qui ne peut s’associer ni au bout + ni au bout • Bloque l'échange et/ou l'hydrolyse de ATP • Empêche l'allongement • Comment utiliser cette actine séquestrée ?

– Système de régulation de la thymosine ? non – Intervention de la profiline ? oui 37

Profiline • Se fixe sur l'extrémité + du monomère à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP (extrémité -) • Bloque ainsi le côté du monomère qui s’associerait normalement à l’extrémité – du filament • Le complexe actine-profiline peut facilement se fixer sur l’extrémité + libre d’un filament.

• Dès que le complexe actine-profiline est additionné  changement de conformation de l’actine  profiline  diminution de l’affinité actine / profiline part  allongement facilité 38

Résumé thymosine-profiline

• Thymosine – Bloque le monomère partout • Profiline – Allonge le filament à son bout + – « Déséquestre » l’actine de la thymosine 39

Fig16-29

– • Profiline liée à un monomère d'actine • Fixée sur l'extrémité + à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP • Peut allonger l’extrémité + du filament • Ne peut pas allonger l’extrémité – du filament + 40

Compétition thymosine – profiline

• Compétition pour se fixer au monomère d’actine • Activation locale de molécules de profiline  libération de l’actine séquestrée par la thymosine 41

Fig16-30(1)

• Résumé : Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine 42

Fig16-30(2)

• Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine 43

Régulation de l’activité de la profiline • Par phosphorylation • Par liaison aux phospholipides inositol (PI) • Protéines intra cellulaires avec domaines riches en proline 44

Sites de régulation de la profiline

• Membrane plasmique • Se lie aux phospholipides de la membrane plasmique • En relation étroite avec l’extérieur pour faire croître lamellipodes ou filopodes 45

b) Tubuline

• C de tubuline libre dans la cellule > C c [tubuline] en monomère en tube à essais • Pourquoi la tubuline soluble ne polymérise-t elle pas en microtubules dans la cellule ?

• Parce qu’il y a des protéines qui séquestrent la tubuline libre 46

La stathmine

• Se fixe sur deux hétérodimères de tubuline et empêche leur addition aux microtubules • Diminue ainsi la concentration de tubuline disponible pour la polymérisation (comme la colchicine) 47

La stathmine

• Taux d’élongation d’un MT = K on • Si [tubuline]   x [tubuline] taux d’élongation   • Or la stathmine  [tubuline] en la séquestrant  • Stathmine  taux d’élongation du MT 48

La stathmine

• Le passage de l’état de croissance au désassemblage du microtubule est une course entre l’hydrolyse du GTP et l’allongement du filament  • Comme la stathmine  séquestrant [tubuline] en la • Stathmine  microtubule le désassemblage du 49

• Effets de la stathmine

Fig16-31

sur la polymérisation des microtubules 50

Régulation de l’activité de la stathmine • Phosphorylation de la stathmine inhibe la fixation à la tubuline  • Phosphorylation de la stathmine –  taux d’élongation du microtubule –  le désassemblage du microtubule (suppression de l’instabilité dynamique) 51

2 Protéines de liaison latérale

Protéines qui se fixent le long du polymère pour le stabiliser ou le déstabiliser a) Tubuline b) Actine 52

a) Protéines de liaison latérale : tubuline

• Les M icrotubules définition) A ssociated P roteins (MAPs) = protéines liées le long des microtubules (par • Peuvent stabiliser les microtubules contre le désassemblage (comme le taxol) • Interaction des microtubules avec les autres composants de la cellule • Forment la structure de base des axones et dendrites 53

Fig16-32

10  m • Localisation des MAPs dans les axones et les dendrites • Protéine  (vert) axone (ramifié) • MAP 2 corps cellulaire et dendrites 54

Deux domaines aux MAPs

• Un domaine lié au microtubule • Un domaine qui se projette en dehors dont la longueur conditionne le degré d’empaquetage des microtubules – MAP 2 : long domaine externe faisceaux de microtubules espacés – Protéines  : domaine externe court faisceaux de microtubules compacts 55

Organisation des faisceaux de MT par les MAPs Cellule surexprimant MAP2 Cellule surexprimant tau

Fig16-33

Biochimie des MAPS (dont tau et MAP2)

• Nombreuses copies d’un motif de liaison à la tubuline • Ces MAPs + tubuline pure non polymérisée  nucléation  par stabilisation des premiers oligomères de tubuline • Cibles de plusieurs protéine kinases 57

MAPs

• MAP2 et tau – Localisées dans certains types de cellules des vertébrés • Autres MAPs – Rôle central dans la dynamique des microtubules chez presque tous les eucaryotes – XMAP215 58

XMAP215

–

enopus

icrotubule

ssociated

rotein (masse molaire=

215

)

– Ubiquitaire – De la levure à l’homme – Se lie le long des microtubules

(devrait être dans § 3)

– Capacité particulière à stabiliser les extrémités libres des microtubules – Inhibe le passage de croissance à raccourcissement des microtubules – Pendant la mitose il y a phosphorylation de XMAP215  inhibition de cette activité  augmentation 10X de instabilité des microtubules 59

Fig.18-12 A

• Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215  • Activité inhibée  microtubules pendant la mitose multipliée par 10 61

b)

Protéines de liaison latérale

: actine

• Tropomyosine • Cofiline (=actine depolymerising factor) 62

Tropomyosine

• Dans la plupart des cellules (pas que dans les cellules musculaires) • Se lie à 7 sous-unités adjacentes d’actine dans le filament • Empêche l’interaction avec d’autres protéines • Rôle dans la contraction musculaire 63

Fig.16-74

Cofiline (=actine depolymerizing factor)

• Déstabilise le filament d’actine • Peut se lier à la fois sur l’actine et sur le filament (inhabituel) • Force le filament à s’enrouler plus serré  affaiblit les contacts entre les sous unités d’actine du filament  filament plus cassant 65

Modification de la morphologie du filament d'actine par la cofiline

Fig16-34

Filament plus court et plus épais 66

Mécanisme d’action 1/2

• Facilite la dissociation d’une sous-unité d’actine-ADP à l’extrémité moins du filament • Or c’est la lenteur de la dissociation à l’extrémité – qui limite le tapis roulant du filament  • La liaison à la cofiline  roulant  accélération du tapis • Le durée de vie des filaments dans la cellule est beaucoup plus courte que de l’actine pure en tube à essais 67

Mécanisme d’action 2/2

• La cofiline préfère se lier à des filaments contenant de l’actine-ADP plutôt que de l’actine-ATP • Or l’hydrolyse de l’ATP est plus lente que l’assemblage du filament  • Les nouveaux filaments contiennent surtout de l’ATP-actine  • La cofiline déstabilise plus les anciens filaments que les nouveaux  • Accélère le turn over des filaments 68

3 Protéines de liaison aux extrémités du filament a) Actine b) Tubuline 69

Justification de ces protéines

• Protéines de liaison latérale ( § 2) – Modifient la dynamique du filament – Mais il en faut beaucoup (doit recouvrir tout le filament) • 1 tropomyosine pour 7 actines • 1 tau pour 4 tubulines • 1 cofiline pour 1 actine • Protéines de liaison aux extrémités du filament ( § 3) – Modifient la dynamique du filament – Mais peuvent être en très faible quantité • 1 molécule par « filament » suffit (

200-500 actines) 1molécule pour 70

a) Protéines de liaison aux extrémités du filament : actine

• Protéines « cappantes » • « cap » l’extrémité + du filament où ont lieu les changements les plus rapides du filament une fois que l’ATP de l’extrémité s’est transformée en ADP  • Ralentit considérablement les vitesses d’allongement et de raccourcissement du filament en rendant l’extrémité + inactive 71

Effet du capping des filaments (actine et pas tubuline) sur leur dynamique

Fig16-35

Protéines cappantes

• • La plupart des filaments sont « capés » à leur extrémité +

eg :

protéine CapZ (strie Z du muscle) • Complexe ARP à l’extrémité – d’un filament (celui qui a permis la nucléation) 73

Régulation du « capping »

• Régulation locale pour adapter le cytosquelette • Signaux intra cellulaires • PIP 2 (phosphatidyl Inositol 2 Phosphate) régule les protéines qui « cappent » l’extrémité + •   de PIP2 dans le feuillet cytosolique  allongement  dé « cappe » l’extrémité + polymérisation en surface • Dans les cellules musculaires durée de vie très longue des filaments d’actine – CapZ au bout + – Tropomoduline au bout – – (+ Tropomysine tout le long pour stabiliser) 74

b) Protéines de liaison aux extrémités du filament : microtubule

• Beaucoup plus compliqué – 13 protofilaments – Tube creux • Rôle dans la dynamique des microtubules • Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules 75

Protéines de liaison aux extrémités du microtubule i.

ii.

 -tubuline ring complex Complexe protéique spécial qu’on trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf. infra) iii. Catastrophines iv. MAPs 76

i -



tubuline ring complex (déjà vu)

• Nuclée le microtubule • « Cap » l’extrémité – 77

ii Complexe protéique spécial qu’on trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf.

infra

) 78

iii. Catastrophines

• Jouent sur la fréquence des « catastrophes » • Tendent à effilocher l’extrémité du filament • Appartiennent à la superfamille des kinésines • Synonyme : famille Kin 1 (qui comprend KIF2 cf. moteurs

infra

) 79

iv. MAPs

• Action inverse : tendent à favoriser la croissance 80

Effets de la liaison de protéines aux extrémités

Fig16-36(A)

Régulation des protéines de liaison aux extrémités du microtubule • Toutes ces protéines sont régulées • C’est ce qui se passe à la mitose 82

Fig.18-12 A

• Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215  • Activité inhibée  microtubules pendant la mitose multipliée par 10 84

Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules • A l’extrémité – :  -tubuline ring complex • A l’extrémité + : protéines de localisation des microtubules dans le cortex cellulaire –

: 85

• Conséquences de la liaison de protéines aux extrémités des microtubules • EB1 = protéine cappante de MT (existe chez l’homme) • Kar9 = protéine localisée vers la membrane

Fig16-36(B)

Permet aux MT du fuseau de se diriger dans le bourgeon de croissance pendant la mitose 86

C Organisation d'ordre supérieur (cross linking)

• Les protéines vues ci-dessus interviennent dans le dynamisme • Il faut aussi stabiliser, assurer l’intégrité mécanique, forme – Centrosome (nucléation, orientation des microtubules, milieu de la cellule…) – MAPs – Tropomyosine … 87

Différentes organisations faisant appel au cross linking • • • Filaments intermédiaires – Association latérale des filaments entre eux – Protéines accessoires Actine – Deux types de protéines (tropomyosine pour stabilisation + autres protéines pour le cross linking) Microtubules – MAPs ont deux domaines (MT, extérieur) 88

Différentes organisations faisant appel au cross linking 1.

Filaments intermédiaires Les différents types d’organisation des filaments d’actine 3. Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique – Microtubules : catanine – Actine : gelsoline 4. Exemple : activation des plaquettes 89

1 Filaments intermédiaires

Organisation du réseau de filaments intermédiaires

• Structure du filament  robustesse – Protéine NF-M et NF-H ont un domaine C terminal qui forme une projection qui se lie aux FI voisins • Filagrine : permet le maintien des faisceaux de FI de kératine • Plectine : nombreuses propriétés 91

Plectine

• Permet le maintien des faisceaux de vimentine • Lie les faisceaux de FI (vimentine) aux – Microtubules – Filaments d’actine – Myosine II – Membrane plasmique 92

• Liaison des filaments intermédiaires intermédiaires aux filaments • Liaison des filaments intermédiaires aux microtubules • Liaison des filaments intermédiaires épais de myosine aux filaments • Grâce à la plectine (anticorps marqués à l'or) Plectine

Fig16-37

MT FI Cross linking de la plectine aux différents éléments du cytosquelette 93

Mutations dans le gène de la plectine • Maladie très grave – Épidermolyse bulleuse (filaments de kératine) – Dystrophie musculaire (filaments de desmine) – Dégénérescence nerveuse (neurofilaments) • Chez la souris – Mort en quelques jours – Phlyctènes de la peau – Atteintes musculaire et cardiaque 94

2 Différents types d'organisation des filaments d'actine

1. Faisceau de filaments 2.

Gel 95

Organisation des filaments d'actine

Fig16-38

Fibres de stress (tension) Exploration de l’environnement 96

 2 types de protéines cross linking 1.

Protéines formant les faisceaux • Filaments parallèles • Connexion rigide entre les deux domaines de liaison à l’actine 2.

Protéines formant un gel ou un réseau • Filaments à grand angle • Connexion à courbe rigide ou flexible Les deux ont deux sites identiques de liaison aux filaments d’actine (monomère ou dimère) 97

• Quatre exemples de protéines de liaison à l'actine • Deux sites de liaison à l'actine (avec séquence proche)

Fig16-39

Exemples de protéines cross linking

• Faisceau • Gel ou réseau 99

Faisceau

• • Fimbrine – 14 nm entre deux filaments – Localisation dans les filopodes et bord avant – Microvillosité  -actinine – 30 nm entre deux filaments (plus lâche) – Fibres de stress – Contacts focaux • Villine – Deux sites proches de liaison à l’actine (  fimbrine) – Microvillosité – Même famille que la gelsoline (cf.

infra

) 100

Gel ou réseau

• Filamine – liaison en V  filaments à angle droit • Spectrine – 200 nm – Forme un réseau  • Les protéines cross linking déterminent le type de structure d’actine… 101

• Formation de deux types de faisceaux d'actine

Fig16-40

 -Actinine purifiée 102

… Les protéines cross linking déterminent le type de structure d’actine… • …et donc le type des autres molécules qui vont interagir •  -actinine  contractiles • Fimbrine  myosine II  fibres de stress exclut la myosine  les filopodes ne sont pas contractiles • Villine   fimbrine 103

Microvillosité

• Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales • 0,08  m x 1  m • Cellules à fonction d’absorption • Augmente la surface d’absorption x20 • Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical • 20 – 30 filaments d’actine en faisceau • Fimbrine + actine • Fibroblaste injecté de villine  longues et plus nombreuses microvillosité plus • Bras latéraux de myosine I entre le faisceau d’actine et les lipides de la membrane plasmique 104

Microvillosité •Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales •0,08  m x 1  m •Cellules à fonction d’absorption •Augmente la surface d’absorption x20 •Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical

Fig16-41(A)

faisceau •Fimbrine + villine •Fibroblaste injecté de villine  microvillosité plus longues et plus nombreuses •Bras latéraux de myosine I entre le faisceau d’actine et les lipides de la membrane plasmique 105

Fig16-41(BC)

• Microvillosité (cryofracture) Contient spectrine et myosine II Au-dessous : couche de filaments intermédiaires 106

•

Fig.

1. A summary of the main events that correlate with the localization of the major actin-binding proteins to the microvilli during brush border formation. Three stages in the assembly of microvilli and the terminal web in the apical cytoplasm of a developing Karl R. Fath and David R. Early membrane projections expressing Burgess Microvillus Assembly: Not actin alone Later, as the microvillus elongates, the Current Biology Volume 5, Issue 6 , June 1995, Pages the microvillus membrane. Both plasma 591-593 to the microvillus by Golgi-derived vesicles. (c) Coincident with the appearance of fimbrin, the number and length of the actin filaments increases and the core filaments become hexagonally packed.

107

Formation de réseau : spectrine

• Conditionne la formation d’un réseau • Identifiée pour la première fois dans les globules rouges • Protéine longue et flexible • 4 chaînes polypeptidiques (Deux  et deux  ) • Les sites d’actine sont séparés de 200 nm • Réseau à 2-D maintenu par de l’actine sous la membrane plasmique dans le globule rouge • Protéines membranaires 108

Fig 10-31

109

Globule rouge

• Cortex cellulaire rigide • Reprise de la forme du globule rouge après passage dans un capillaire • Équivalents de spectrine dans le cortex des autres types cellulaires des vertébrés 110

Formation d’un gel : filamine

• Servent dans les lamellipodes qui permettent à la cellule de ramper sur un support 111

Formation d'un gel (3-D) par la filamine

Fig16-42

112

Fig16-43

• Cellules de mélanome – Peu de filamine (mobilité anormale) • Pas de lamellipodes • Bulles anormales à la surface • Peu de déplacement • Pas de métastase – Restauration artificielle de la filamine • Lamellipodes • Hautement métastasiante 113

3 - Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique • Cassure d’un filament (en des douzaines de fragments)  nombre d’extrémités + et –  – Sous certaines conditions :  nucléation et  allongement des sites de – Sous d’autres conditions: dépolymérisation des vieux filaments  –  – Changement des propriétés physiques et mécaniques du cytoplasme – Les faisceaux et gels deviennent plus fluides 114

Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique

Fig16-44

115

Intervention de protéines cassantes sur la longueur et la dynamique des MF et microtubules

a) Microtubules – Katanine b) Actine – Gelsoline 116

a - Microtubules : katanine

• « épée » en japonais • Peut casser les 13 protofilaments d’un microtubule • Deux sous-unités – Petite : hydrolyse ATP + casse le protofilament – Grosse : dirige la katanine vers le centrosome 117

Rôle de la katanine

• Libère les microtubules de leur point d’attache à un centre organisateur de microtubules • Applications – Dépolymérisation rapide des microtubules aux pôles du fuseau à la mitose – Cellules en prolifération – Neurones 118

Fig16-45

• Cassure des microtubules par la katanine – 30 s après l'addition de Katanine – Même champ 3 minutes après l'addition de la Katanine MT marqués par la rhodamine et stabilisés par le taxol adsorbés sur une plaque de verre 119

b Microfilaments d’actine : gelsoline • Superfamille des gelsolines • Peut casser le filament d’actine • Activité activée par une forte [Ca ++ ] cytosolique • Ne nécessite pas d’ATP 120

Gelsoline

• Possède des sous-domaines dont deux sites • Qui se lient à deux sites différents de la sous unité d’actine – Un à la surface du filament – Un caché dans la liaison avec la sous-unité suivante 121

Mode d’action présumé de la gelsoline • Liaison sur le côté d’un filament d’actine par un des 2 sites de liaison de la gelsoline à l’actine • Fluctuation thermique  fente entre des sous unités voisines du protofilament d’actine • Infiltration de la gelsoline dans la fente  • Cassure du filament • « Capping » de la gelsoline à l’extrémité du filament par son 2 ème site de fixation à l’actine • Peut être retirée du filament par une augmentation de PIP 2 122

• Modèle de cassure du filament d'actine par la gelsoline

Fig16-46

123

4 - Application : activation des plaquettes • Très bel exemple de • Régulation des protéines accessoires à l’actine • Cassure, « capping », cross linking  • Grosses modifications morphologiques 124

Plaquette au repos

• Circule dans le sang • Pas de noyau • Forment le caillot • Forme discoïde • Actine sous forme de filaments courts • « Cappés » par CapZ • Beaucoup de monomères d’actine liés à la profiline 125

Activation de la plaquette

• Par contact physique avec un vaisseau endommagé • Ou agent chimique comme la thrombine 126

Mécanisme de l’activation

• Cascade de signalisation intra cellulaire  – Afflux massif de Ca ++ dans le cytosol – Ca ++ active gelsoline – Gelsoline casse et « cap » les filaments en filaments plus petits – Qui sont maintenant « cappés » de gelsoline • Cascade de signalisation intra cellulaire  –  de PIP 2  – Inactivation de gelsoline et CapZ – Qui sont retirées toutes les deux  127

Mécanisme de l’activation

• Augmentation du nombre d’extrémités libres • Qui sont rapidement allongés par les nombreuses sous unités libres d’actine  • Nombreux filaments longs 128

Intervention des autres protéines de liaison à l’actine • Ces nombreux filaments longs sont transformés en gel par la gelsoline • D’autres sont transformés en faisceaux par  actinine et fimbrine 129

Fin de l’activation de la plaquette

• Formation de lamellipodes et filopodes pour recouvrir le caillot • Et fixation des plaquettes au caillot par des intégrines 130

Retour au repos

• Le signal PIP 2 s’affaisse • CapZ retourne aux extrémités des filaments • Les filaments redeviennent stables • Les plaquettes reprennent leur forme étalée • Myosine II hydrolyse de l’ATP pour glisse le long des filaments d’actine les uns par rapport aux autres  • Contraction de la plaquette qui rapproche les berges de la plaie 131

• Activation plaquettaire

Fig16-47(A)

132

• Activation plaquettaire Avant l’activation Plaquette activée Après contraction de la myosine II

Fig16-47(BCD)

133

D Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique • Rôle du cytosquelette dans la forme et la rigidité de la membrane plasmique de la cellule – Cortex du GR : réseau actine + spectrine – Microvillosité : faisceau actine + villine • Deux facteurs dans le maintien de ces structures – Maintien des filaments d’actine en faisceau et cross linking des filaments – Fixation spécifique des filaments d’actine aux protéines ou lipides de la membrane plasmique • De plus connexion des structures internes de la cellule à son environnement – Autres cellules – Matrice extra cellulaire 134

Continuum entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule • • Éléments du cytosol >< Actine et filaments intermédiaires >< protéines transmembranaires  adhésion cellulaire

Cf. chapitre matrice extra cellulaire pour connexions membrane cellulaire



matrice extra

135

Famille ERM (Ezérine – Radixine – Moésine) • Protéines intra cellulaires proches les unes des autres • Attachent les filaments d’actine à la membrane plasmique – Extrémité – C de la protéine se lie directement au filament d’actine – Extrémité - N de la protéine se lie à la face cytoplasmique de glycoprotéines trans membranaires dont CD44 (récepteur à l’acide hyaluronique) 136

Neurofibromatose

• Maladie génétique • Tumeurs nerveuses bénignes multiples • Mutations dans les protéines ERM • Mutation  perte d’une protéine (appelée merline) de la famille ERM 137

•

Merlin

-organized complexes prevent mitogenic signaling and contact-dependent inhibition of proliferation. (

Left

) At low cell density in cell culture, Merlin is predominantly hyperphosphorylated and inactive and mitogenic signaling proceeds. Similarly, upon cell reattachment to certain ECM substrates, a pool of Merlin is rapidly phosphorylated. (

Right

) At high cell density in cell culture, Merlin is hypophosphorylated, self-associated, and active in mediating contact-dependent inhibition of proliferation. Merlin is recruited to nascent cell:cell boundaries where it appears to stabilize AJs between cells, perhaps by inhibiting Rac/Pak signaling and/or stabilizing the actin cytoskeleton. Under these conditions, Merlin may inhibit signaling from AJ-associated growth-factor receptors. Hypophosphorylated Merlin can also interact with cell:ECM receptors such as CD44, which binds to hyaluronic acid (HA); increased CD44:HA interaction with increased cell density leads to high levels of active Merlin, which may inhibit associated growth-factor receptors. Notably, complete cell detachment also leads to hypophosphorylation and activation of Merlin. Perhaps inhibited mitogenic signaling from multiple complexes accumulates, reaching a threshold that halts proliferation. The study and manipulation of cell:cell contact in two dimensions in cell culture is nonphysiological; in vivo cells in a tissue are contacting other cells and can override contact-dependent inhibition of proliferation under certain normal conditions or in the context of a tumor. Merlin may coordinate the receipt of physical information from the extracellular milieu with the receipt and processing of mitogenic stimuli.

GENES & DEVELOPMENT 19:2265-2277, 2005

REVIEW

Membrane organization and tumorigenesis —the NF2 tumor suppressor, Merlin

Andrea I. McClatchey and Marco Giovannini

138

Régulation des protéines d’attachement des filaments d’actine à la membrane plasmique • Spectrine ou myosine I  signaux intra cellulaires régulation par des • Protéines ERM  régulation par des signaux intra et extra cellulaires 139

Les deux conformations des protéines ERM • Conformation déroulée active : oligomérise et se lie à l’actine et à CD44 • Conformation repliée inactive : les extrémités N – et C – terminales sont liées entre-elles • Passage d’une conformation à l’autre – Phosphorylation – Liaison à PIP 2 En réponse à des signaux extra cellulaires 140

• Rôle des protéines de la famille ERM dans l'attachement des filaments d'actine à la membrane plasmique

Fig16-48

(ezrine, radixine, moésine)

141

Rapport du cytosquelette avec les jonctions cellulaires

1. Cytosquelette  2. Cytosquelette  matrice extra cellulaire cellule voisine 142

1 - Cytosquelette  matrice extra cellulaire : contacts focaux • Terminaison à leur niveau des fibres de stress constituées de faisceaux d’actine et myosine II • Présence d’intégrines à leur niveau • Intégrines

(cf chapitre MEC)

– Protéines d’adhésion trans-membranaire – Se lient indirectement aux faisceaux d’actine 143

Fonctions des contacts focaux

• Permet à la cellule de tirer sur son support : via fibres de stress • Relais de signaux de la matrice extra cellulaire vers le cytosol : via FAK 144

Focal Adhesion Kinase (FAK)

• C’est une tyrosine kinase • Activée par l’agrégation des intégrines des contacts focaux • Sensible au substrat de la cellule et la force de tension : comment ??

• Cible de la Src tyrosine kinase cytoplasmique • Phosphoryle de nombreuse cibles réponse à l’environnement  régule survie, croissance, prolifération, morphologie, mouvement, différenciation des cellules en 145

• Contacts focaux et fibres de stress dans un fibroblaste en culture

Fig16-49

Microscopie à contraste interférentiel Anticorps anti-actine 146

2 - Cytosquelette  cellule voisine: cadhérines • Protéines trans-membranaires • Queue cytoplasmique se lient aux caténines qui se lient à l’actine • Jonctions adhérentes = amas de contacts cellules cellules à cadhérine-actine 147

• Molécule de cadhérine

Fig 19-24 A-B

148

Fig 19-24 C

149

Autres structures cytosquelette  cellule voisine : desmosomes et hémidesmosomes • Filaments intermédiaires – membrane plasmique • Desmosomes : cellules - cellules • Hémidesmosomes : cellules - matrice 150

Retentissement des signaux extra cellulaires sur le cytosquelette :

deux cibles

Protéines associées aux éléments du cytosquelette • • Longueur, localisation , organisation dynamique Signal extra cellulaire  protéines accessoires cytosquelette via 2.

• • GTPases monomériques membres de la famille des protéine Rho* À l’intérieur de la cellule

* (ne pas confondre avec Rab



amarrage des protéines de transport

Cible de nombreux récepteurs membranaires 151

Famille des protéines Rho

• • Rho GTP-Binding Proteins – Une grande famille de protéines monomériques de liaison au GTP impliquée • Dans la régulation de l’organisation de l’actine • L’expression des gènes • Et la progression du cycle cellulaire

This enzyme was formerly listed as EC 3.6.1.47. Year introduced: 2000

152

• • • • • • • •

Rho signalling at a glance

spectrum of effectors to stimulate downstream signaling pathways. The pathways shown in the poster represent the major effector pathways for these Rho family GTPases. The total number of effectors is too large to be shown here, and I apologize to authors whose work could not be included. [Excellent reviews for these effector pathways are available; for detailed information, please see (Bishop and Hall, 2000; Symons and Settleman, 2000; Bokoch, 2003; Ridley, 2001; Yoshimi et al., 2001;

Sci 117, 5457-5458 (2004) J. Cell

cytokinesis and is also implicated in other aspects of cell cycle progression. Mammalian diaphanous protein 1 (mDia1, also known as dia-related formin or DRF), mDia2 and mDia3 mediate both actin polymerization through a profilin-dependent mechanism and stabilization of microtubule plus ends in cell migration.

kinases also phosphorylate the Na/H +

Schwartz

(LIMK), which phosphorylates cofilin to release actin monomers and promote actin polymerization; and myosin regulatory light chain itself, which again promotes contractility. Rho kinase phosphorylates ezrin-radixin-moesin (ERM) family proteins to activate their function as linkers between actin and the plasma membrane. Rho antiporter NHE-1 to promote actin-membrane interactions and several intermediate filament proteins (desmin, vimentin and glial fibrillary acidic protein) to regulate intermediate filament structure.

Both Rac and Rho bind to phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (PIP5K); activation of PIP5K by Rho also requires Rho kinases. Production of phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)P 2 ] contributes to the activation of ERM proteins and to actin polymerization through WASP, profilin and multiple actin-capping proteins.

Other reported substrates for Rho kinases that are not pictured include MARCKS, EF-1, calponin, CPI-17 and collapsin-response mediator protein 2.

Rac has numerous effectors that mediate effects on the cytoskeleton and gene expression. Rac binds p67 PHOX to increase activation of the NADPH oxidase system and production of reactive oxygen species (ROS), which mediate activation of NF-B-dependent gene expression, effects of Rac on cell cycle progression and inhibition of Rho activity. Rac binds the WAVE complex (also containing Abi and IRSp53/58), to release active WAVE, which promotes actin polymerization in lamellipodia through activation of the Arp2/3 complex. Both Rac and Cdc42 bind and activate the kinases PAK1, PAK2 and PAK3. PAKs have multiple substrates, including LIM kinase, which leads to actin polymerization; OP18/stathmin, which stabilizes microtubule plus ends; and Raf-1 and MEK1, whose phosphorylation by PAK enhances transmission of the signal to ERK. PAK activity also regulates myosin phosphorylation and cell contractility through several pathways, including myosin light chain kinase, myosin regulatory light chain, myosin heavy chain and caldesmon. Other pathways not listed on the diagram include filamin A, which cooperates with PAK to promote membrane ruffling; components of the paxillin-GIT/PKL-P1X complex, which regulates cell adhesion and motility; and the apoptotic regulator BAD, which promotes cell survival.

Rac and Cdc42 are important activators of Jun N-terminal kinase (JNK) and p38, which stimulate AP-1-dependent gene expression. Mixed lineage kinases (MLKs) appear to be the major Rac/Cdc42 effectors leading to JNK and p38 activity. Rac and Cdc42 also bind to the actin-binding protein IQGAP, which is implicated in regulation of cell-cell adhesion. Both Rac and Cdc42 also bind and stimulate PI 3-kinase. The resultant 3'-phosphorylated lipids bind to and stimulate Rac GEFs, creating a positive feedback loop that maintains cell migration.

WASP (and the more widely expressed N-WASP) are critical downstream effectors of Cdc42 that mediate formation of filopodia. These effectors also require PtdIns(4,5)P 2 and interact directly with Arp2/3 complex to promote actin polymerization. Cdc42 activates the serine/threonine kinase MRCK, which is related to Rho kinases and can promote myosin phosphorylation. Cdc42 also activates the tyrosine kinases ACK1 and ACK2; the latter regulates focal adhesion formation and organization of the actin cytoskeleton. Cdc42 promotes oncogenic transformation in part by binding to the and coatamer proteins and regulating membrane trafficking.

Finally, Cdc42 is the critical determinant of polarity in a wide variety of developmental systems; this involves binding of Cdc42 to PAR6. PAR6 is a component of a complex containing PAR3 and atypical protein kinase C (PKC or PKC). This complex regulates positioning of the microtubule-organizing center (MTOC) in migrating cells and early embryos, and tight junction formation in epithelia. Borg proteins are Cdc42 effectors that connect to septins, structural proteins that can polymerize to form filaments involved in cytokinesis in yeast and mammalian cells, and that probably carry out additional structural roles in mammalian cells as well (Joberty et al., 2001).

Finally, the poster displays some of the major feedback loops among Rho GTPases and their effector pathways. Formation of integrin-dependent cell-ECM adhesion formation, cadherin-dependent cell-cell adhesion formation and PI 3-kinase activation influence the function of GEFs and GAPs for Rho family GTPases. These positive and negative regulatory loops appear to be important for cell motility and perhaps other processes.

153

Famille des protéines Rho

• • • Appartiennent à la super famille Ras 3 membres de la famille GTPases 1. Cdc42 : active WASp 2. Rac : active WASp (dans sa forme GTP) 3. Rho Agissent comme des interrupteurs moléculaires – Actif : liaison au GTP – Inactif : liaison au GDP 154

Fig. 3-70

155

Le cycle de la GTPase Rho

• • • • Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described: Rho (three isoforms: A, B, C); Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif;

Etienne-Manneville,S2002p629

They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their C terminus, and this is required for function. Rnd proteins are exceptional in that they do not hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis.

GDI : guanine nucleotide exchange inhibitors 156

• Active WASp

1 - Cdc42

157

2 - Rac-GTP

• Active WASp • Active PI(4)P-5 kinase  • Génère PI(4,5)P2  • Dé - « capping » des filaments dont l’extrémité + est liée à la gelsoline ou CapZ  • Plus de sites d’assemblage à l’actine près de la membrane plasmique  • Lamellipodes et ondulations 158

3 - Rho-GTP

• Active une protéine kinase qui inhibe une phosphatase qui agit sur les chaînes légères de myosine  • Augmentation des chaînes légères de myosine phosphorylées  • Augmentation de l’activité contractile de la myosine  • Augmentation des fibres de stress 159

• Illustration Fig 16-67 A 160

Fig 16-67 B • Coloration négative en microscopie électronique de filaments de myosine II (plus courts que ceux que l’on trouve dans la cellule musculaire striée) assemblés

in vitro

par phosphorylation de leurs chaînes légères 161

Membres de la famille WASp • • Conformation inactive repliée / active dépliée (comme ERM) • Protéine WASp + cdc 42-GTP  stabilisation de la forme ouverte  liaison à ARP   de l’activité de nucléation du complexe ARP  • Nucléation de l’actine 162

Dynamique et organisation de l’actine 1. Activation de cdc 42  – – Polymérisation de l’actine Formation de faisceaux  – Filopodes et spicules 2. Activation de – rac  Polymérisation de l’actine à la périphérie de la cellule  – Lamellipodes et ondulations 3. Activation de rho  – – Formation de faisceaux d’actine avec de la myosine II pour former des fibres de stress Formation de contacts focaux par agglomération d’intégrines et protéines associées 163

Mode d’action de ces 3 « interrupteurs » • • Nombreuses protéines cibles en aval  modifications de l’organisation et de la dynamique de l’actine 164

Le cycle de la GTPase Rho

• Les 3 membres de la famille Rho fonctionnent de façon semblable • Activation par GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) (on en connaît plus de 20) • Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described: Rho (three isoforms: A, B, C); Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif; and TTF. They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their

Etienne-Manneville,S2002p629

hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis.

165

• Effets de Rho, Rac, et Cdc42 sur l'organisation de l'actine dans le fibroblaste (actine colorée à la pholloïdine fluorescente, contacts focaux colorés par AC anti vinculine)

Fig16-50

Nombreuses fibres de stress et contacts focaux Énorme lamellipode qui fait le tour de la cellule Nombreux filopodes en périphérie 166

Alan Hall Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton

Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998, p 509

•

Fig. 1.

Rho, Rac, and Cdc42 control the assembly and organization of the actin cytoskeleton. Quiescent, serum-starved Swiss 3T3 fibroblasts (-) contain very few organized actin filaments (

) or vinculincontaining integrin adhesion complexes (

). The effects of Rho, Rac, or Cdc42 activation in these cells can be observed in several different ways such as with the addition of extracellular growth factors, microinjection of activated GTPases, or microinjection of guanosine diphosphate (GDP) –guanosine triphosphate (GTP) exchange factors. Addition of the growth factor lysophosphatidic acid activates Rho, which leads to stress fiber (

) and focal adhesion formation (

). Microinjection of constitutively active Rac induces lamellipodia (

) and associated adhesion complexes (

). Microinjection of FGD1, an exchange factor for Cdc42, leads to formation of filopodia (

) and the associated adhesion complexes (

). Cdc42 activates Rac; hence, filopodia are intimately associated with lamellipodia, as shown in (G). In (A), (C), (E), and (G), actin filaments were visualized with rhodamine phalloidin; in (B), (D), (F ), and (H), the adhesion complexes were visualized with an antibody to vinculin. Scale: 1 cm 5 25 mm. [Figure courtesy of Kate Nobes] 167

Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509 Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton •

Fig. 4.

ERM proteins are required for GTPase-mediated cytoskeletal changes. It has been proposed that ERM proteins exist in a closed (inactive) conformation and an open (active) conformation. There is evidence to suggest that this transition can be regulated by Rho, perhaps through the activation of a Ser-Thr kinase or a lipid kinase (through PIP2). In the active conformation, the NH2-terminus of ERM proteins (pink) can interact with transmembrane proteins, such as CD44, whereas the COOH-terminus (blue) interacts with F-actin. This membrane –ERM–F actin unit is an essential prerequisite for the Rho GTPases to induce cytoskeletal changes. In the case of Rho, this is likely to be mediated by the bundling and reorganization of preexisting actin-myosin filaments to generate stress fibers, whereas in the case of Rac and Cdc42 it is likely that preexisting filaments are uncapped to allow actin polymerization and filament growth leading to the formation of lamellipodia and filopodia.

168

Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509 Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton •

Fig. 5.

Cdc42p-associated signaling complexes in

S. cerevisiae

. Cdc42p is essential for both pheromone- induced mating and for nitrogen starvation –induced filamentous growth. In the pheromone response, Bem1p acts a scaffold protein and interacts with Cdc24p (an exchange factor for Cdc42p), Far1p (a cell cycle inhibitor), actin, Ste20p (a Ser Thr kinase that can interact with Cdc42p), and Ste5p. Ste5p is a scaffold protein that interacts with components of a MAP kinase cascade. Ste20p activates the MAP kinase cascade, but no interaction with Cdc42p is required. A role of Cdc42p is to localize this signaling complex to the mating projection. Cdc42p and Ste20p are also required to activate a distinct MAP kinase pathway (still not completely defined) in response to nitrogen starvation. In this case, the interaction between Cdc42p and Ste20p is essential.

169