Transcript Desafios analíticos para implantação da RDC 45-2012
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Laboratório de Análises Químicas
Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – Brasil
Fone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128
[email protected]
www.teanalitica.com.br
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
AMOSTRAGEM
ENCONTRO ABRASP
30 out 2013
T&E Analítica
T&E Analítica
Flávio Leite2013
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Aproximadamente 6 metros de comprimento
MEIOS SISTÊMICOS BIOLÓGICO – pHs – via oral
BOCA/ESÔFAGO
pH= jejum alim
4,9 5,2
6,1 5,4
6,3 5,1
6,4
Médio e Distal
pH= entre 5 - 6
pH= entre 1 - 3,5
ESTÔMAGO
pH=
DUODENO
Temperatura 37ªC
jejum
alim
4,,4 - 6,5 5,2 - 6,0
6,6
6,2
JEJUNO
INTESTINO
DELGADO
COLON
TRANSVERSO
INTESTINO
GROSSO
COLON
ASCENDENTE
T&E Analítica
ÍLEO
pH=
jejum
alim
6,5
6,8 - 7,8
6,8 - 8,0 6,8 - 8,0
7,4
7,5
COLON
DESCENDENTE
Ref.: Michael E.AultoN 2ª EDIÇÃO
DELINEAENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS
2013
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DECOMPOSIÇÃO E DEGRADAÇÃO
É quando um composto sofre alteração estrutural para compostos menores ou
maiores, mais estáveis em determinada condição de temperatura e pressão.:
REAÇÕES DE DECOMPOSIÇÃO (Análise)
Quando um composto exposto de forma natural a condições como:
calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
Quando um composto é exposto de forma forçada a condições como:
calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO
A espécie final formada, pode ser produto de várias reações.
A espécie estável final está em função do conjunto de energias aplicadas.
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IMPUREZAS
IMPUREZAS DA ROTA QUÍMICA OU IMPUREZAS RELATADAS
Resíduos de solventes utilizados na fabricação e presença de metais/semi/ametais.
Produtos de reações secundárias. Impurezas intrínsecas à matéria-prima.
IMPUREZAS DE DECOMPOSIÇÃO
Geradas pela instabilidade natural do compostos. Geradas, após a composição e
armazenamento do produto final (contato embalagem, contato insumos, temperatura
de armazenamento). Geradas nos meios sistêmicos do organismo biológico.
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Geradas após exposição em situação de estresse.
ENSAIO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA
Elaborado para o estudo de NOVOS
FÁRMACOS E ESTABILIDADE
Pesquisa: Interferência de Potência e ou natureza genotóxicas.
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2013
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IMPUREZAS – PUBLICAÇÕES ANVISA
ICH
International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.
Requisitos para IMPUREZAS EM NOVOS MEDICAMENTOS
- várias públicações: QA/QB/QC/QD e Guide Lines
ESPÉCIE DE
Lim: Not-Id-Qt INTENSIDADE
ANVISA OBJETO LOCALIZADOR
ESTRESSSE
ICH (10-30%) ESTRESSANTE
RE 899, de Validação de
Item2Não define
Não traz no corpo
Não define
29/05/2003 Métodos
Especificidade e
da norma
Seletividade 2.1.2
IT 1 de
Esclareciment
Toda a IT 1 temperatura/umidade/ Traz no corpo da IT 60°C;75%UR;
15/07/2008 o da
RE
oxidação/luz/hidrólise
HCl e NaOH 0,1N;
1 de
e Ions Metálicos
H2O2 3% ;
29/07/2005
UV-B; Fe2 ou Cu2
0,05M
C P 11, de Impurezas
Toda a CP 11 temperatura/umidade/ Traz no corpo da
Não define
23/01/2012 Degradação
oxidação/luz/hidrólise
CP
e Ions Metálicos
RDC 45 de Estabilidade
Seção VIII temperatura/umidade/ Não traz no corpo
Não define
09/08/2012 de Insumos
art.36-39
oxidação/luz/hidrólise
da norma
Farmacêuticos
T&E Analítica
"IN VIVO"
Não define
Não define
Art.8
§5 Toxici e
Genotoxi
Não define
2013
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Notificação – Identificação - Qualificação
ICH - IMPURITIES IN NEW DRUG
SUBSTANCES – Q3A(R2) oct/2006
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2013
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ICH- ÁRVORE PARA IDENTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO - Q3A(R2) oct/2006
New Drugs Products - NOVOS MEDICAMENTOS
É impureza com limite
superior de Identificação
sim
Considere a população de pacientes e duração
de uso e considerar a realização de:
a) Os estudos de genotoxicidade (mutação de
ponto, aberração cromossômica)
b) Estudos toxicidades gerais (uma espécie,
geralmente 14 a 90 dias)
c) Outros parâmetros de toxicidades específicas.
(conforme o caso).
não
Sem ação
Estrutura
Identificada?
sim
Algum conhecimento sim
de risco relevante
ao ser humano?
Reduzir Limite
de segurança
não
Reduzir para
não mais que
o limite de
Identificação?
sim
Sem novas
medidas
Algum efeito
adverso clínico
relevante?
não
sim
sim
Reduzir
para não mais
que o limite de
Qualificação?
sim
Maior que o
limite de
Qualificação?
Reduzir Limite
de segurança
não
não
Sem ação
Qualificado
não
T&E Analítica
não
2013
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USO DE ESTRESSANTES PELA CP 11
ESTRESSAR:
-Matéria prima do ATIVO que compõe o formulado
-Placebo do formulado
-Produto formulado ou acabado
ESTRESSANTES:
1- Aquecimento
2- Umidade
3- Solução Ácida
4- Solução Básica
5- Solução Oxidante
6- Exposição Fotolítica
7- Ions metálicos
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DEFINIÇÃO PARA O STRESS:
Degradar de 10 a 30% do ATIVO
Dificuldades:
-Parar a reação e manter o equilíbrio
-Isolar a impureza
-Quantificar/Identificar a impureza
-Genotoxi (principalmente pela qdade)
2013
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ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Toda reação química para acontecer
necessita de energia. Esta energia e
denominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Reag
Prod
Caminho da reação
Caminho da reação
ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Luminosidade/Ausência de Luz
Resfriamento-Aquecimento
Metais ou sais – Ácidos-Bases
Oxigênio / Enzimas
Hidratação/Desidratação
Reações secundárias
Radiação Ionizante e N.Ionizante
Outras possíveis
Caminho da reação
∆H
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Slide 10
REAÇÕES QUÍMICAS
ESCALA MACRO São reações que ocorrem em previsão para concentrações
acima de 1% em massa ou volume.
H+
Ácido Oleico (c/impurezas) + Metanol (c/impurezas) Oleato de Metila + Água + impurezas
(a.palmítico,
esteárico,
C4,C6, etc)
(etanol,
formol,
a.fórmico,etc
(palmitado e
estearato/
metila e etila)
ESCALA MICRO São reações que ocorrem de forma secundária e nem sempre
previstas dentro dos parâmetros teóricos da química reacional.
Material orgânico em decomposição + cloro CH4 + Cl2 várias possibilidades
IMPUREZA DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO
Podem ocorrer na escala MACRO como na escala MICRO, sendo
a escala MICRO a mais complexa para identificação e quantificação.
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REAÇÕES E MECANISMOS DAS REAÇÕES
Mecanismos:
- homolítico, heterolítico, pericíclico[
- nucleófilo, eletròfilo
Formação de Cadeias Carbônicas:
- normal e ramificada
- aromática
- cíclica normal e ramificada
- alicíclica normal e ramificada
- alquil /aromática/ciclica/alicíclica
Reações:
- adição, substituição, eliminação
- salificação, esterificação,
- oxidação branda, exaustiva e combustão
- redução , polimerização
Considerando as moléculas da Farmacêutica, para alterar o equilíbrio do meio a
a seguinte matriz deve ser olhada para o interferente e produto:
Fator 1- Concentração
(quanto menor , maior deve ser Fator 2 e ou Fator 3)
Fator 2-Tempo de contato
Fator 3 - Energia aplicada
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(agitação, temperatura, radiação, etc)
2013
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AÇÃO DE ESTRESSANTE ÚNICO E COMBINADO - Previsão
1
1
2
2
3
3
T&E Analítica
4
5
tempo
4
5
tempo
6
6
7
7
8
8
10
10
1
1
2
2
3
3
4
5
tempo
4
5
tempo
6
6
7
7
8
8
10
10
2013
Slide 13
PREVISÕES DE REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
Considerando o Produto acrescido de
Estressante
1 - Pode resultar em precipitações ou solubilizações na solução do produto,
2 - Pode ocorrer polimerizações,
3 - Pode alterar as estruturas e não “aparecerem” na condição analítica
(principalmente nas reações com NaOH e HCl),
4 - Pode ocorrer alteração de cor, que dificultará a análise na condição analítica,
5 - Extração com solvente, pode-se supor que a impureza não seja extratível
e ou ainda gerar IOV,
6 - Interações do tipo excipiente-excipiente ; ativo-excipiente ; embalagem
7- Reações conhecidas da química, como oxidação de aldeídos a alcoóis,
hidrólise de ésteres, adições, quebras, etc
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Slide 14
SOBRE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Técnicas separativas: HPLC e CFG em seus detectores
ANÁLISE DE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO POR OUTRAS TÉCNICAS
Nem todas as técnicas permitem análise de impurezas de degradação
Exemplo 1: Volumetria, colorimetria, potenciometria, absorção a luz ultravioleta e visível,
infravermelho, etc..
Exemplo 2: Compostos que possuem sua quantificação por métodos microbiológicos,
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO PARA METAIS, SEMI-METAIS E AMETAIS
Em casos que a alteração do número de oxidação é de fundamental importância na aplicação.
Exemplo 1: o antimônio utilizado no tratamento da “úlcera de Bauru”, no qual a mudança
do número de oxidação do antimônio resultada em dor elevada quando ministrado na forma
injetável muscular.
Exemplo 2: aplicação sobre complexos metálicos, na relação: quelato / não quelato
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Sistema Físico de Separação – ALTERAÇÃO DO SINAL
ANÁLISE
Condição Analítica : análise sem validação
Método:
análise com validação
Área=700
Área=1000
Área= 1000
Área= 700
Área= 300
Agentes estressantes
LB
Mat.prima ou
Placebo ou
Formulado
LC-UV/Vis
GC-FID
Área=1200
Não visível
aquele detectpr
Área= 650
Submeter um produto a estressantes pode alterar o sinal analítico da espécie em
análise para aquele sistema de detecção.
As alterações podem resultar em diferentes interpretações. As justificativas podem
ser dirigidas para fenômenos Químicos e ou Físicos.
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2013
Slide 16
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Para as análises no estudo de ID o cuidado com o equipamento é importante,
não apenas aos danos materiais, mas às falsas interpretações de resultados.
Estressante
LB
M.Prima
LB
M.prima+Es
LB
Placebo
LB
Placebo+Es
LB
Prod.Acabado
LB
Prod.Acabado+Es
LB
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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Duas situações são colocadas para as Impurezas
PRESENTES ou INDUZIDAS em um fármaco
ANALISANDO COM O MÉTODO/CONDIÇÃO ANALÍTICA (CA) :
Situação 1- a Cond.Analítica utilizada VISUALIZA a impureza
gerada pelo estresse.
Situação 2- a Cond.Analítica utilizada NÃO VISUALIZA a
impureza gerada pelo estresse.
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Slide 18
SITUAÇÃO – 2 – NÃO VISUALIZA
Considerando técnicas separativas: CFG; HPLC, etc
O MÉTODO
NÃO VISUALIZA:
Utilizando-se deste método sobre as amostras colocadas sob os efeitos de energia (stress)
poderão resultar em espécies que não sejam absorvidas pela LUZ ULTRAVIOLETA, desta
forma, o sinal analítico não será percebido e não se pode deduzir que houve impureza.
Absorve no UV
Absorve no UV
NÃO Absorve no UV
Qual direção analítica utilizar? Quantos métodos serâo necessários?
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2013
Slide 19
SISTEMAS DE EXTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO
Extração Líquido/Líquido
Extração Líquido/Vapor)
Extração Contra Corrente
Extração por Ppdades Coligativas
Cromatografia Preparativa
Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de Coluna
SPE - SPME - SBE
SPE = Solid Phase Extraction
SPME = Solid Phase Micro Extraction
Mistura Líquida
“Sobre” agulha
Adsorvente
-Analito fica retido
-É extraído com solvente
em função da polaridade
Resina Polar;
Apolar/Interm.
CFG
Demais Componentes
Líquido
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2013
Slide 20
CC e CCD (TLC)
Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de Coluna
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2013
Slide 21
HPLC PREPARATIVA
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2013
Slide 22
ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA
DE FORMA BEM SIMPLIFICADA
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
- Determina fragmentos e Peso Molecular
INFRA VERMELHO
- Determina grupos funcionais
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
- Determina posições na Cadeia Carbônica
ABSORÇÃO AO ULTRA-VIOLETA
- Determina a presença de insaturações
CC e CCD
- Determinações da Química Clássica
ICP (Inductively Coupled Plasma)
- Determina metais/ametais/semi-metais
ACOPLAMENTOS
- LC/MS; LC/MSMS; GC/MS ; MIC/IV; LC/TOF; LC/PDA
F-X (Fluorescência X)
RAIO-X - DIFRAÇÃO
MICROSCOPIA
MEV/EDS
ANÁLISE ELEMENTAR (CHNSO)
ABSORÇÃO AO VISÍVEL
COLORIMETRIA
AED (Detector de Emissão Atômica)
ANÁLISE TÉRMICA ATD/ATG - DSC
- Determina metais/semi-metais
- Determina Polimorfismo/Estrutura cristlina
- Determina: Polimosfismo/Tamanho de Partícula
- Determina análise elementar
- Determina a composição Centesimal
- Determina a presença de cromóforos
- Determinações da Química Clássica
- Determina composição centesimal
- Determina decomposição da molécula; polimorfismo
Caso um proposta é obtida: o nome atribuído a impureza pode não ser
comparado aos nomes existentes no mercado.
(se houver)
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2013
Slide 23
ENSAIOS FARMACÊUTICOS PARA TOXICIDADE GENÉTICA
ANVISA :
- RE 90- de 16 de março de 2004: “Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de
fitoterápicos”
- Ofício Circular no 002/2009/GGTOX) Gerência Geral de Toxicologia Brasília 08/09/2009
- GUIA PARA A CONDUÇÃO DE ESTUDOS NÃO CLÍNICOS DE SEGURANÇA NECESSÁRIOS AO
DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS - Gerência de Avaliação de Segurança e Eficácia - GESEF
Neles incluem-se:
- toxicidade aguda
- toxicidade de doses repetidas (longa duração)
- estudo especial - Genotoxicidade
Aqui Apresentados:
1- TOXICIDADE
2- TOXICIDADE
3- MUTAGENICIDADE
4- MUTAGENICIDADE
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: Daphnia
: DL 50 e CL 50
: Ensaio de AMES
: Ensaio Micronúcleo
2013
Slide 24
TOXICIDADE/GENOTOXICIDADE
1- O ensaio de toxicidade só é possível com o isolamento da(s) espécie(s), o que é
complexo, para ter massa suficiente para a identificação/quantificação e suficiente
para toxicidade.
Obs.: Uma substância testada em toxicidade isolada, pode não ser tóxica
quando no formulado
Genotoxicidade não e uma medida de Carcinogenicidade (Indicador
para o câncer)
Mutagenicidade mede evento inicial ou intermediário do processo de
tumorigenese
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2013
Slide 25
TOXICIDADE AGUDA POR DAPHNIA
O ensaio consiste básicamente na exposição do microcrustáceo de água
doce Daphnia magna em diferentes condições, visando assim a detectar
seus efeitos letais e/ou subletais em estudos de avaliação de toxicidade
O Ensaio:
-para cada concentração observa-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos indivíduos após o
período de exposição de 24 e 48 horas, encerrando o teste após 48 horas.
Resultados:
Porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade / quantidade de indivíduos no início do ensaio
Quanto maior a porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade dos indíviduos no tempo
do ensaio, maior a toxicidade
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2013
Slide 26
TOXICIDADE - DL 50 ( Dose Letal Média)
A morte é universal:
Todas as drogas são capazes de causar a morte. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados
em determinado período de tempo é denominada de dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e
a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT).
Algumas substâncias já possuem literatura quanto a degradação e toxicidade destas
impurezas. O ácido ascórbico tem sua degradação em 10% em massa inicial da
seguinte forma:
?
Vamos parar de consumir laranja,
acerola, entre outras fontes da Vit C?
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2013
Slide 27
MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE AMES
O ensaio de AMES , determina mutagenicidade utilizando de Cepas (estirpes)
Salmonella typhimurium. O ensaio mede a indução de mutações reversas em cepas auxotróficas
(His-) para o aminoácido Histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem).
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2013
Slide 28
MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE MICRONUCLEO
O teste do micronúcleo, sendo um teste citogenético, consiste
na investigação de células previamente expostas a agentes químicos,
com a finalidade de detectar possíveis aberrações cromossômicas.
O teste baseia-se num aumento da freqüência de eritrócitos policromáticos com micronúcleos, utilizandose para isso, preferencialmente, células de mamíferos (medula óssea ou sangue periférico de
animais devidamente tratados. (camundongos machos e jovens).
Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: grupo controle
negativo, grupo-controle positivo (administra-se substância reconhecidamente indutora de mutagênese
p.ex
ciclofosfamida 50mg/Kg) e grupo-teste (administra-se a substância teste ).
Quantidade de coletas em tempos máximos determinados, devem
ser rigorosamente observados. Os micronúcleos normalmente
são visualizados usando-se de diferentes técnicas, entre elas
a coloração de Giemsa ou a Fluorescência . A quantificação
é por microscopia.
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2013
Slide 29
MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO
CP - 11
ETAPA 1A- BUSCA DA IMPUREZA DE DEGRADAÇÃO CONSIDERANDO
MP Ativo PLACEBO FORMULADO BRANCO
ENSAIOS TÉCNICA PERTINENTE
Tfinal
Tfinal
Tfinal
Stressante
(LC-DAD, HPLC-UV/Vis , CFG ou GC/MS)
Teor Ativo (dupl) ANTES colocar as quantidades (tzero )
*Teor impurezas conhecidas antes
Teor do ativo+Imp LUZ - FINAL de cada dia
Teor do ativo+Imp UMIDADE - FINAL de cada dia
Teor do ativo+Imp-TEMPERATURA - FINAL de cada dia (60oC)
Teor do ativo+Imp-OXIDAÇÃO - FINAL 2 conc de cada dia
Teor do ativo+Imp-HIDRO ÁCIDA- FINAL 2 conc de cada dia
Teor do ativo+Imp- HIDRO BÁSICA- FINAL 2 conc de cada dia
Teor ativo+Imp OXIREDUÇÃO-FINAL,2 conc,2 reagde cada dia
Prazo: 10 a 20 dias
Quantificação NOVAS Imp Fator Resposta Ativo ou Área%
Incremento de análises diárias (1 a 20 dias)
TOTAL ANÁLISES=
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2013
Slide 30
MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO
CP 11
ETAPA 2- ISOLAMENTO IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por TLC, CC ou LC/Prep
Prazo: 20 a 50 dias
ETAPA 3- PROPOSTA DE IDENTIFICAÇÃO DA IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por DAD/MS/IV
Prazo: 10 a 30 dias
ETAPA 4- QUANTIFICAÇÃO FATOR RESPOSTA IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por LC ou GC
Prazo: 5 a 15 dias
ETAPA 5- GENOTOXICIDADE
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de Impurezas
DL 50
Daphineas
AMES
Micronuclideo
Outros métodos
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Prazo: 3 a 12 meses
2013
Slide 31
PRINCIPAIS REFERÊNCIAS
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2013
Slide 32
OBRIGADO
Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – Brasil
2013
Fone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128
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Laboratório de Análises Químicas
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Fone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128
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ENCONTRO ABRASP
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Aproximadamente 6 metros de comprimento
MEIOS SISTÊMICOS BIOLÓGICO – pHs – via oral
BOCA/ESÔFAGO
pH= jejum alim
4,9 5,2
6,1 5,4
6,3 5,1
6,4
Médio e Distal
pH= entre 5 - 6
pH= entre 1 - 3,5
ESTÔMAGO
pH=
DUODENO
Temperatura 37ªC
jejum
alim
4,,4 - 6,5 5,2 - 6,0
6,6
6,2
JEJUNO
INTESTINO
DELGADO
COLON
TRANSVERSO
INTESTINO
GROSSO
COLON
ASCENDENTE
T&E Analítica
ÍLEO
pH=
jejum
alim
6,5
6,8 - 7,8
6,8 - 8,0 6,8 - 8,0
7,4
7,5
COLON
DESCENDENTE
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DECOMPOSIÇÃO E DEGRADAÇÃO
É quando um composto sofre alteração estrutural para compostos menores ou
maiores, mais estáveis em determinada condição de temperatura e pressão.:
REAÇÕES DE DECOMPOSIÇÃO (Análise)
Quando um composto exposto de forma natural a condições como:
calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
Quando um composto é exposto de forma forçada a condições como:
calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO
A espécie final formada, pode ser produto de várias reações.
A espécie estável final está em função do conjunto de energias aplicadas.
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IMPUREZAS
IMPUREZAS DA ROTA QUÍMICA OU IMPUREZAS RELATADAS
Resíduos de solventes utilizados na fabricação e presença de metais/semi/ametais.
Produtos de reações secundárias. Impurezas intrínsecas à matéria-prima.
IMPUREZAS DE DECOMPOSIÇÃO
Geradas pela instabilidade natural do compostos. Geradas, após a composição e
armazenamento do produto final (contato embalagem, contato insumos, temperatura
de armazenamento). Geradas nos meios sistêmicos do organismo biológico.
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Geradas após exposição em situação de estresse.
ENSAIO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA
Elaborado para o estudo de NOVOS
FÁRMACOS E ESTABILIDADE
Pesquisa: Interferência de Potência e ou natureza genotóxicas.
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IMPUREZAS – PUBLICAÇÕES ANVISA
ICH
International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.
Requisitos para IMPUREZAS EM NOVOS MEDICAMENTOS
- várias públicações: QA/QB/QC/QD e Guide Lines
ESPÉCIE DE
Lim: Not-Id-Qt INTENSIDADE
ANVISA OBJETO LOCALIZADOR
ESTRESSSE
ICH (10-30%) ESTRESSANTE
RE 899, de Validação de
Item2Não define
Não traz no corpo
Não define
29/05/2003 Métodos
Especificidade e
da norma
Seletividade 2.1.2
IT 1 de
Esclareciment
Toda a IT 1 temperatura/umidade/ Traz no corpo da IT 60°C;75%UR;
15/07/2008 o da
RE
oxidação/luz/hidrólise
HCl e NaOH 0,1N;
1 de
e Ions Metálicos
H2O2 3% ;
29/07/2005
UV-B; Fe2 ou Cu2
0,05M
C P 11, de Impurezas
Toda a CP 11 temperatura/umidade/ Traz no corpo da
Não define
23/01/2012 Degradação
oxidação/luz/hidrólise
CP
e Ions Metálicos
RDC 45 de Estabilidade
Seção VIII temperatura/umidade/ Não traz no corpo
Não define
09/08/2012 de Insumos
art.36-39
oxidação/luz/hidrólise
da norma
Farmacêuticos
T&E Analítica
"IN VIVO"
Não define
Não define
Art.8
§5 Toxici e
Genotoxi
Não define
2013
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Notificação – Identificação - Qualificação
ICH - IMPURITIES IN NEW DRUG
SUBSTANCES – Q3A(R2) oct/2006
T&E Analítica
2013
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ICH- ÁRVORE PARA IDENTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO - Q3A(R2) oct/2006
New Drugs Products - NOVOS MEDICAMENTOS
É impureza com limite
superior de Identificação
sim
Considere a população de pacientes e duração
de uso e considerar a realização de:
a) Os estudos de genotoxicidade (mutação de
ponto, aberração cromossômica)
b) Estudos toxicidades gerais (uma espécie,
geralmente 14 a 90 dias)
c) Outros parâmetros de toxicidades específicas.
(conforme o caso).
não
Sem ação
Estrutura
Identificada?
sim
Algum conhecimento sim
de risco relevante
ao ser humano?
Reduzir Limite
de segurança
não
Reduzir para
não mais que
o limite de
Identificação?
sim
Sem novas
medidas
Algum efeito
adverso clínico
relevante?
não
sim
sim
Reduzir
para não mais
que o limite de
Qualificação?
sim
Maior que o
limite de
Qualificação?
Reduzir Limite
de segurança
não
não
Sem ação
Qualificado
não
T&E Analítica
não
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USO DE ESTRESSANTES PELA CP 11
ESTRESSAR:
-Matéria prima do ATIVO que compõe o formulado
-Placebo do formulado
-Produto formulado ou acabado
ESTRESSANTES:
1- Aquecimento
2- Umidade
3- Solução Ácida
4- Solução Básica
5- Solução Oxidante
6- Exposição Fotolítica
7- Ions metálicos
T&E Analítica
DEFINIÇÃO PARA O STRESS:
Degradar de 10 a 30% do ATIVO
Dificuldades:
-Parar a reação e manter o equilíbrio
-Isolar a impureza
-Quantificar/Identificar a impureza
-Genotoxi (principalmente pela qdade)
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ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Toda reação química para acontecer
necessita de energia. Esta energia e
denominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Reag
Prod
Caminho da reação
Caminho da reação
ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Luminosidade/Ausência de Luz
Resfriamento-Aquecimento
Metais ou sais – Ácidos-Bases
Oxigênio / Enzimas
Hidratação/Desidratação
Reações secundárias
Radiação Ionizante e N.Ionizante
Outras possíveis
Caminho da reação
∆H
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REAÇÕES QUÍMICAS
ESCALA MACRO São reações que ocorrem em previsão para concentrações
acima de 1% em massa ou volume.
H+
Ácido Oleico (c/impurezas) + Metanol (c/impurezas) Oleato de Metila + Água + impurezas
(a.palmítico,
esteárico,
C4,C6, etc)
(etanol,
formol,
a.fórmico,etc
(palmitado e
estearato/
metila e etila)
ESCALA MICRO São reações que ocorrem de forma secundária e nem sempre
previstas dentro dos parâmetros teóricos da química reacional.
Material orgânico em decomposição + cloro CH4 + Cl2 várias possibilidades
IMPUREZA DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO
Podem ocorrer na escala MACRO como na escala MICRO, sendo
a escala MICRO a mais complexa para identificação e quantificação.
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REAÇÕES E MECANISMOS DAS REAÇÕES
Mecanismos:
- homolítico, heterolítico, pericíclico[
- nucleófilo, eletròfilo
Formação de Cadeias Carbônicas:
- normal e ramificada
- aromática
- cíclica normal e ramificada
- alicíclica normal e ramificada
- alquil /aromática/ciclica/alicíclica
Reações:
- adição, substituição, eliminação
- salificação, esterificação,
- oxidação branda, exaustiva e combustão
- redução , polimerização
Considerando as moléculas da Farmacêutica, para alterar o equilíbrio do meio a
a seguinte matriz deve ser olhada para o interferente e produto:
Fator 1- Concentração
(quanto menor , maior deve ser Fator 2 e ou Fator 3)
Fator 2-Tempo de contato
Fator 3 - Energia aplicada
T&E Analítica
(agitação, temperatura, radiação, etc)
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AÇÃO DE ESTRESSANTE ÚNICO E COMBINADO - Previsão
1
1
2
2
3
3
T&E Analítica
4
5
tempo
4
5
tempo
6
6
7
7
8
8
10
10
1
1
2
2
3
3
4
5
tempo
4
5
tempo
6
6
7
7
8
8
10
10
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PREVISÕES DE REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
Considerando o Produto acrescido de
Estressante
1 - Pode resultar em precipitações ou solubilizações na solução do produto,
2 - Pode ocorrer polimerizações,
3 - Pode alterar as estruturas e não “aparecerem” na condição analítica
(principalmente nas reações com NaOH e HCl),
4 - Pode ocorrer alteração de cor, que dificultará a análise na condição analítica,
5 - Extração com solvente, pode-se supor que a impureza não seja extratível
e ou ainda gerar IOV,
6 - Interações do tipo excipiente-excipiente ; ativo-excipiente ; embalagem
7- Reações conhecidas da química, como oxidação de aldeídos a alcoóis,
hidrólise de ésteres, adições, quebras, etc
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SOBRE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Técnicas separativas: HPLC e CFG em seus detectores
ANÁLISE DE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO POR OUTRAS TÉCNICAS
Nem todas as técnicas permitem análise de impurezas de degradação
Exemplo 1: Volumetria, colorimetria, potenciometria, absorção a luz ultravioleta e visível,
infravermelho, etc..
Exemplo 2: Compostos que possuem sua quantificação por métodos microbiológicos,
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO PARA METAIS, SEMI-METAIS E AMETAIS
Em casos que a alteração do número de oxidação é de fundamental importância na aplicação.
Exemplo 1: o antimônio utilizado no tratamento da “úlcera de Bauru”, no qual a mudança
do número de oxidação do antimônio resultada em dor elevada quando ministrado na forma
injetável muscular.
Exemplo 2: aplicação sobre complexos metálicos, na relação: quelato / não quelato
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Sistema Físico de Separação – ALTERAÇÃO DO SINAL
ANÁLISE
Condição Analítica : análise sem validação
Método:
análise com validação
Área=700
Área=1000
Área= 1000
Área= 700
Área= 300
Agentes estressantes
LB
Mat.prima ou
Placebo ou
Formulado
LC-UV/Vis
GC-FID
Área=1200
Não visível
aquele detectpr
Área= 650
Submeter um produto a estressantes pode alterar o sinal analítico da espécie em
análise para aquele sistema de detecção.
As alterações podem resultar em diferentes interpretações. As justificativas podem
ser dirigidas para fenômenos Químicos e ou Físicos.
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Para as análises no estudo de ID o cuidado com o equipamento é importante,
não apenas aos danos materiais, mas às falsas interpretações de resultados.
Estressante
LB
M.Prima
LB
M.prima+Es
LB
Placebo
LB
Placebo+Es
LB
Prod.Acabado
LB
Prod.Acabado+Es
LB
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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Duas situações são colocadas para as Impurezas
PRESENTES ou INDUZIDAS em um fármaco
ANALISANDO COM O MÉTODO/CONDIÇÃO ANALÍTICA (CA) :
Situação 1- a Cond.Analítica utilizada VISUALIZA a impureza
gerada pelo estresse.
Situação 2- a Cond.Analítica utilizada NÃO VISUALIZA a
impureza gerada pelo estresse.
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SITUAÇÃO – 2 – NÃO VISUALIZA
Considerando técnicas separativas: CFG; HPLC, etc
O MÉTODO
NÃO VISUALIZA:
Utilizando-se deste método sobre as amostras colocadas sob os efeitos de energia (stress)
poderão resultar em espécies que não sejam absorvidas pela LUZ ULTRAVIOLETA, desta
forma, o sinal analítico não será percebido e não se pode deduzir que houve impureza.
Absorve no UV
Absorve no UV
NÃO Absorve no UV
Qual direção analítica utilizar? Quantos métodos serâo necessários?
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SISTEMAS DE EXTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO
Extração Líquido/Líquido
Extração Líquido/Vapor)
Extração Contra Corrente
Extração por Ppdades Coligativas
Cromatografia Preparativa
Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de Coluna
SPE - SPME - SBE
SPE = Solid Phase Extraction
SPME = Solid Phase Micro Extraction
Mistura Líquida
“Sobre” agulha
Adsorvente
-Analito fica retido
-É extraído com solvente
em função da polaridade
Resina Polar;
Apolar/Interm.
CFG
Demais Componentes
Líquido
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CC e CCD (TLC)
Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de Coluna
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HPLC PREPARATIVA
T&E Analítica
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ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA
DE FORMA BEM SIMPLIFICADA
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
- Determina fragmentos e Peso Molecular
INFRA VERMELHO
- Determina grupos funcionais
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
- Determina posições na Cadeia Carbônica
ABSORÇÃO AO ULTRA-VIOLETA
- Determina a presença de insaturações
CC e CCD
- Determinações da Química Clássica
ICP (Inductively Coupled Plasma)
- Determina metais/ametais/semi-metais
ACOPLAMENTOS
- LC/MS; LC/MSMS; GC/MS ; MIC/IV; LC/TOF; LC/PDA
F-X (Fluorescência X)
RAIO-X - DIFRAÇÃO
MICROSCOPIA
MEV/EDS
ANÁLISE ELEMENTAR (CHNSO)
ABSORÇÃO AO VISÍVEL
COLORIMETRIA
AED (Detector de Emissão Atômica)
ANÁLISE TÉRMICA ATD/ATG - DSC
- Determina metais/semi-metais
- Determina Polimorfismo/Estrutura cristlina
- Determina: Polimosfismo/Tamanho de Partícula
- Determina análise elementar
- Determina a composição Centesimal
- Determina a presença de cromóforos
- Determinações da Química Clássica
- Determina composição centesimal
- Determina decomposição da molécula; polimorfismo
Caso um proposta é obtida: o nome atribuído a impureza pode não ser
comparado aos nomes existentes no mercado.
(se houver)
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ENSAIOS FARMACÊUTICOS PARA TOXICIDADE GENÉTICA
ANVISA :
- RE 90- de 16 de março de 2004: “Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de
fitoterápicos”
- Ofício Circular no 002/2009/GGTOX) Gerência Geral de Toxicologia Brasília 08/09/2009
- GUIA PARA A CONDUÇÃO DE ESTUDOS NÃO CLÍNICOS DE SEGURANÇA NECESSÁRIOS AO
DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS - Gerência de Avaliação de Segurança e Eficácia - GESEF
Neles incluem-se:
- toxicidade aguda
- toxicidade de doses repetidas (longa duração)
- estudo especial - Genotoxicidade
Aqui Apresentados:
1- TOXICIDADE
2- TOXICIDADE
3- MUTAGENICIDADE
4- MUTAGENICIDADE
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: Daphnia
: DL 50 e CL 50
: Ensaio de AMES
: Ensaio Micronúcleo
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TOXICIDADE/GENOTOXICIDADE
1- O ensaio de toxicidade só é possível com o isolamento da(s) espécie(s), o que é
complexo, para ter massa suficiente para a identificação/quantificação e suficiente
para toxicidade.
Obs.: Uma substância testada em toxicidade isolada, pode não ser tóxica
quando no formulado
Genotoxicidade não e uma medida de Carcinogenicidade (Indicador
para o câncer)
Mutagenicidade mede evento inicial ou intermediário do processo de
tumorigenese
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TOXICIDADE AGUDA POR DAPHNIA
O ensaio consiste básicamente na exposição do microcrustáceo de água
doce Daphnia magna em diferentes condições, visando assim a detectar
seus efeitos letais e/ou subletais em estudos de avaliação de toxicidade
O Ensaio:
-para cada concentração observa-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos indivíduos após o
período de exposição de 24 e 48 horas, encerrando o teste após 48 horas.
Resultados:
Porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade / quantidade de indivíduos no início do ensaio
Quanto maior a porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade dos indíviduos no tempo
do ensaio, maior a toxicidade
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TOXICIDADE - DL 50 ( Dose Letal Média)
A morte é universal:
Todas as drogas são capazes de causar a morte. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados
em determinado período de tempo é denominada de dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e
a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT).
Algumas substâncias já possuem literatura quanto a degradação e toxicidade destas
impurezas. O ácido ascórbico tem sua degradação em 10% em massa inicial da
seguinte forma:
?
Vamos parar de consumir laranja,
acerola, entre outras fontes da Vit C?
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MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE AMES
O ensaio de AMES , determina mutagenicidade utilizando de Cepas (estirpes)
Salmonella typhimurium. O ensaio mede a indução de mutações reversas em cepas auxotróficas
(His-) para o aminoácido Histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem).
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MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE MICRONUCLEO
O teste do micronúcleo, sendo um teste citogenético, consiste
na investigação de células previamente expostas a agentes químicos,
com a finalidade de detectar possíveis aberrações cromossômicas.
O teste baseia-se num aumento da freqüência de eritrócitos policromáticos com micronúcleos, utilizandose para isso, preferencialmente, células de mamíferos (medula óssea ou sangue periférico de
animais devidamente tratados. (camundongos machos e jovens).
Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: grupo controle
negativo, grupo-controle positivo (administra-se substância reconhecidamente indutora de mutagênese
p.ex
ciclofosfamida 50mg/Kg) e grupo-teste (administra-se a substância teste ).
Quantidade de coletas em tempos máximos determinados, devem
ser rigorosamente observados. Os micronúcleos normalmente
são visualizados usando-se de diferentes técnicas, entre elas
a coloração de Giemsa ou a Fluorescência . A quantificação
é por microscopia.
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MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO
CP - 11
ETAPA 1A- BUSCA DA IMPUREZA DE DEGRADAÇÃO CONSIDERANDO
MP Ativo PLACEBO FORMULADO BRANCO
ENSAIOS TÉCNICA PERTINENTE
Tfinal
Tfinal
Tfinal
Stressante
(LC-DAD, HPLC-UV/Vis , CFG ou GC/MS)
Teor Ativo (dupl) ANTES colocar as quantidades (tzero )
*Teor impurezas conhecidas antes
Teor do ativo+Imp LUZ - FINAL de cada dia
Teor do ativo+Imp UMIDADE - FINAL de cada dia
Teor do ativo+Imp-TEMPERATURA - FINAL de cada dia (60oC)
Teor do ativo+Imp-OXIDAÇÃO - FINAL 2 conc de cada dia
Teor do ativo+Imp-HIDRO ÁCIDA- FINAL 2 conc de cada dia
Teor do ativo+Imp- HIDRO BÁSICA- FINAL 2 conc de cada dia
Teor ativo+Imp OXIREDUÇÃO-FINAL,2 conc,2 reagde cada dia
Prazo: 10 a 20 dias
Quantificação NOVAS Imp Fator Resposta Ativo ou Área%
Incremento de análises diárias (1 a 20 dias)
TOTAL ANÁLISES=
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MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO
CP 11
ETAPA 2- ISOLAMENTO IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por TLC, CC ou LC/Prep
Prazo: 20 a 50 dias
ETAPA 3- PROPOSTA DE IDENTIFICAÇÃO DA IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por DAD/MS/IV
Prazo: 10 a 30 dias
ETAPA 4- QUANTIFICAÇÃO FATOR RESPOSTA IMPUREZA
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas
Impureza por LC ou GC
Prazo: 5 a 15 dias
ETAPA 5- GENOTOXICIDADE
ENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de Impurezas
DL 50
Daphineas
AMES
Micronuclideo
Outros métodos
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Prazo: 3 a 12 meses
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PRINCIPAIS REFERÊNCIAS
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OBRIGADO
Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – Brasil
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Fone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128
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