6. Miško medžių mikrodauginimas 6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr. V. Baliuckas). 6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų ūkyje (dr.
Download ReportTranscript 6. Miško medžių mikrodauginimas 6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr. V. Baliuckas). 6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų ūkyje (dr.
Slide 1
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 2
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 3
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 4
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 5
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 6
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 7
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 8
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 9
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 10
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 11
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 12
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 13
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 14
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 15
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 16
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 17
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 18
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 19
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 20
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 21
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 22
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 2
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 3
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 4
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 5
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 6
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 7
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 8
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 9
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 10
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 11
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 12
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 13
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 14
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 15
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 16
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 17
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 18
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 19
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 20
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 21
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Slide 22
6. Miško medžių
mikrodauginimas
6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr.
V. Baliuckas).
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų
ūkyje (dr. A. Pliūra).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
6.1 Mikrodauginimo metodai
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje
aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė
hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004).
Definicijos
Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir
struktūras.
Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų
morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso,
meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas
organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė;
kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas –
morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas).
Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje.
In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje
(laboratorijoje).
Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios
naujus audinius.
Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas
augalas in vitro sąlygose
Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš
neapvaisintos kiaušidės audinių
Pagrindinis vegetatyvinio ir
mikrodauginimo privalumas –
greitas identiškų tam tikro
individo kopijų gavimas.
Lytinio dauginimo atveju reikia laukti
lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p.
eglei), be to 1/2 genų gaunama iš
tėvinio genotipo, kas gali būti
nepageidaujama. LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Masinio vegetatyvinio miško medžių
dauginimo metodai
Pagrindinai metodai:
1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz.
kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis
lapuočiams).
2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš
kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse
sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų
(tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze).
3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų
somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės)
suliejimo metodas.
4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų
medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir
augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas).
P. eglės donoriniai medeliai
augūnų šaknydinimui
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Mikrodauginimo metodų derinio
schematinis pavaizdavimas
Galimi 3 pagrindiniai
organogenezės metodai:
a) tiesioginė mikroūglių
indukcija iš eksplanto audinių
ir jų šaknydinimas,
b) adventyvinių (spontaninių)
pumpurų indukcija, pumpurų
sprogimas ir ūglių išauginimas
a)
b)
c)
c) ūglių indukcija iš kaliuso ir
tolesnis šaknydinimas
adventitious - plant parts, such as shoots
and roots, produced in an unusual
position on a plant or at an unusual time
of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
1. Organogenzė
Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi
procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų
diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar
suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo
terpėje) ląstelių.
Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės
žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė
neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės
funkcijos neatliekančių ląstelių masė,
vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui
reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu,
įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas,
mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu.
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Organogenezės etapai
•
•
•
•
Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų,
nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros
iniciacija,
Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų
išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių
proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą
skatinančioje terpėje),
Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą
skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos),
Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje.
adventitious - plant
parts, such as shoots
and roots, produced in
an unusual position on a
plant or at an unusual
time of development.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Maitinimo terpės ir hormonai
•Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios
terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai,
maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz.
gliukozė)
•Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime
naudojamos tokios pagrindinės grupės:
•Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių
pumpurų vystymąsi.
•Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius.
•Giberelinai skatina sėklų dygimą.
•Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų
susidarymo iš kaliuse stimuliacijai.
•Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą.
•Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
2. Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra
somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikrodauginimo metodas kai gemalai išauginami iš
vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų
pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame
P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų
azote neribotam laikui.
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms
ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip
paverčiami į dirbtines sėklas.
institutas, Švedija )
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius
medelynuose (pigu).
Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo)
ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš
nelytinių ląstelių.
Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)
Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės
sėklos gamybos principas: gemalas
apvelgams kietų maismedžiagių lukštu,
kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra
preinams maisto rezervas gemalui.
•Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas,
kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti
laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet
kada gali būti paimti somatiniam gemalų
klonavimui.
•Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso
nuo rūšies):
•Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai
įsišaknija)
•Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai
lengvai įsišaknija)
•SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P.
radiata, Picea glauca x engelmanni
•“iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha
miško” (Timmis 1998).
Užšaldymas skystame
azote (t žemiau –
100C)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Vienų metų amžiaus p. pušies
medeliai išauginti somatinės gemalų
genezės būdu: medeliai nesiskiria
nuo įprastinių iš sėklų išaugintų
medelių (Švedijos miškų institutas).
Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai
išauginti somatinės gemalų genezės
būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš
sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų
institutas).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinės gemalų genezės vystymo strategija
Džordžijos technologijos institute, JAV
Iš somatinių gemalų išauginti Picea
glauca medeliai Kanadoje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Pagrindiniai somatinės gemalų
genezės pasiekimai miškų ūkyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima
sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido
chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų
sumai.
Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai:
- gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų);
- sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu
būdu;
- iš gautų ląstelių išauginti naują augalą.
•Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell
wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su
tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų
augalų selekcines linijas.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Somatinė hibridizacija
Bulvės protoplastai – matomi žali
chloroplasto grūdeliai
Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą
Iš kalio besiformuojantis naujas augalas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti
somatiniai hibridai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Somatinė hibridizacija
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/
Augūnų šaknydinimas
•Donoriniai augalai (ang.
hedges) auginami medelyne
iki 3 m. amžiaus, t.y.
pakankamas augalo
pajėgumas produkuoti ūglius
karpymui
•Donorinių augalų ūgliai
karpomi ir šaknydinami, taip
gaunant jų kopijas, kurias
galima veisti miške
•Intensyvumas dindinamas
priklausomai nuo mažiaus
•Didėjant amžiui, ūglių
šaknijimosi potencija mažėja.
Pvz. p. eglės optimalus
Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti
amžius 3-10 m.
vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos
miškų institutas 1998.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
P. eglės
augūnai iš
jaunesnių
medelių
(augimas
panašus kaip
sėjinukų)
Paprastosios eglės augūnai iš
vyresnių medžių (augimas kaip
šakų- linkimas į šoną).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo
sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Literatūros sąrašas
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification.
Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences,
V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.
Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In:
Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth
Press Inc., p. 167-191.
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics
and breeding of forest trees, p. 263-291.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN:
082470794X. Publisher: CRC.
Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science
and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.
Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
ISBN 9986-433-36-3.
Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering
of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody
plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS