Transcript 实验六 酶促反应中的竞争性抑制 《食品生物化学实验 》课程 一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响 二、实验原理 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的 氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态 的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显 的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性 越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢， 可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙 二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。 由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色， 所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。 三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取 取新鲜猪心一个（100g），切碎，加 100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4，放入组织捣碎机 中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离 心15min，0-4℃ ，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提 取液。（各组共用） 2、竞争性抑制观察 取四支指形管，按下表依次加入各种液体 （CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形 管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀， 立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体 后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止 观察变色情况。 管号 CK 1%琥珀酸（滴） 5%琥珀酸（滴） 1%丙二酸（滴） 水 （滴） 酶液 （滴） 8煮沸 根据酶活力情况调整 10min （20 ） （20 ） （20 ） 滴数 （20 ） 甲烯蓝 （滴） 石蜡油 （滴）

实验六
酶促反应中的竞争性抑制
《食品生物化学实验 》课程
一、实验目的
1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法
2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用
3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响
二、实验原理
琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的
氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态
的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显
的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性
越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢，
可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙
二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。
由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色，
所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。
三、实验步骤
1、琥珀酸脱氢酶的提取
取新鲜猪心一个（100g），切碎，加
100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4，放入组织捣碎机
中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离
心15min，0-4℃ ，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提
取液。（各组共用）
2、竞争性抑制观察
取四支指形管，按下表依次加入各种液体
（CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形
管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀，
立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体
后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止
观察变色情况。
管号
CK
1
2
3
1%琥珀酸（滴）
10
10
10
0
5%琥珀酸（滴）
0
0
0
10
1%丙二酸（滴）
0
0
1
1
水
（滴）
1
1
0
0
酶液
（滴）
8煮沸
8
8
8
根据酶活力情况调整
10min
（20 ）
（20 ）
（20 ）
滴数
（20 ）
甲烯蓝 （滴）
1
1
1
1
石蜡油 （滴）
5
5
5
5
四、实验结果
各指形管反应变色时间
管号 起始时间
结束时间
变色时间（分、秒）
1
2
3
注：加入石蜡油封闭后开始计算时间，观察1、2、3号哪个退色最快，这
个时间长一些，需要耐心等待、观察。2号最慢；1和3快。
五、讨论分析
1、对比1号管与2号管之间、2号管与3号管之
间变色时间的差异，并做出合理的解释
（底物、抑制剂、浓度等）。
（1）1号管与2号管比较时间长短，解释原因。
（2）2号管与3号管比较时间长短，解释原因。
2、封石蜡后为什么不能震荡?
六、改进实验建议
仪器和试剂
主要仪器：烧杯，滴管，指形管，离心机，
组织捣碎机，恒温水浴锅。
• 1/15 mol•L-1 Na2HPO4（pH 7.4）
• 1%琥珀酸，5%琥珀酸，1%丙二酸（琥珀酸、
丙二酸用NaOH调正至pH7.4）
• 0.02%甲烯蓝，石蜡油