Cultivos celulares y sus aplicaciones

Instituto de Oncología “Angel H. Roffo” Área de Investigación Dpto. Biología Celular

El cultivo celular

Téc. Alicia Rivelli

Breve introducción histórica

      

En 1907 el Dr. Harrison de rana cultivó células del tubo neural de embrión En 1910 el Dr. Burrows pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de cultivó explantos de tejido de embrión de células de mamíferos.

Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre células cultivadas.

En 1952 se establece la origen humano) línea celular HeLa (primera línea celular de Durante la década del 70 los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética.

En 1975 los Drs. Koehler y Milstein establecen la primera celular productora de anticuerpos monoclonales.

línea En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular a permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.

¿Para qué cultivar células in vitro?



ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN: comprender la fisiología celular, toxicología, y virología.



INGENIERIA DE TEJIDOS: transplantes , injertos (piel, hígado, hueso, cartílago).



PRODUCCIÓN DE BIOLOGICOS: anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.)



CITOGENÉTICA: estudios cromosómicos.



TRANSGENICOS: organismos genéticamente modificados.

Diferentes tipos de cultivos de tejidos:



Cultivo de órganos:

mantenimiento de órganos o parte de órganos

in vitro

(por ejemplo corazón).



Cultivo de tejidos y explantes:

mantenimiento de tejidos

in vitro.



Cultivo de células

Cultivo de células:

 Se define como el conjunto de aislamiento de técnicas de células y obtención de poblaciones celulares

in vitro

, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Diferentes tipos de cultivos celulares Primario:

iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo.

Líneas celulares:

primario, a partir del primer subcultivo exitoso.

se origina del cultivo

Línea celular continua:

células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

Cultivo primario: Pasos:



Aislamiento del tejido de interés.



Disociación mecánica y enzimática del tejido



Obtención de la suspensión celular.



Siembra en soporte adecuado para la proliferación en monocapa o en suspensión.

Subcultivos

 Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (máxima proliferación posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porción células y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).

Crecimiento celular: En monocapa Las células crecen En suspensión

Células en monocapa

 Los cultivos cuyas células son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de células adheridas al plástico o vidrio.

 Para despegar las células se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.

Células en monocapa

Células en suspensión

 Las células que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (característico de células hematopoyéticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente.

 El repique se realiza mediante una de la suspensión celular.

dilución

Líneas celulares continuas BHK: fibroblastos de hámster cirio dorado.

CrFK: fibroblasto de riñón gato doméstico.

riñón MDCK: epitelio de riñón canino.

CHO: epitelio de ovario de hámster chino.

HeLa: epitelio tumoral de cuello uterino humano.

MDBK: epitelio de riñón adulto.

HUVEC: endotelio de vena umbilical humana

Línea celular LM3

   Línea celular establecida a partir de pasajes sucesivos

in vitro

de un cultivo M3.

primario del adenocarcinoma mamario murino El adenocarcinoma mamario M3 surgió espontáneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del

Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”.

Las células LM3 presentan un fenotipo altamente muestran una invasivo y metastásico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo morfología epitelial poliédrica

ABAC Asociación Banco Argentino de Células Desde 1987 administra mantiene y líneas celulares en distintos centros de investigación, proveyendo células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.

Mantenimiento de líneas celulares



Repique o pasaje:

células en cultivo.

para mantener las 

Congelación

preservar las

(criopreservación):

para próximos usos.

células a lo largo del tiempo (años) y mantener un stock para los

Criopreservación



Técnica:

    Se levanta la monocapa por Se obtiene una tripsinización suspensión celular.

Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min, para separar la fracción celular del medio de cultivo.

El pellet celular se resuspende en medio de congelación (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol –anticongelantes )

Criopreservación

   Se fraccionan en criotubos.

Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en heladera y luego se la lleva a freezer -80 °C durante 24-48 hs Se guardan en tanque de nitrógeno líquido

Componentes del medioambiente del cultivo: Medio de cultivo

:( aporta nutrientes, vitaminas etc.)

Suplementos:

(ej suero que aporta factores de crecimiento)

pH:

( ej: 7,4 )

Temperatura:

(ej. 37 ° C)

Gas:

Dióxido de carbono (ej. 5 7%)

Soportes:

materiales adecuados para el crecimiento (ej vidrio, plástico, biológicos etc.)

Medios de cultivo

Suplementos

Atmósfera y temperatura

 Estufa de cultivo con atmósfera de Dióxido de carbono

Soportes

  Estériles Generalmente se utiliza material de plástico:

Soportes

 Biológicos:

El laboratorio de cultivo celular

 Además del equipamiento usual se requiere: 

Microscopios:

invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.

El laboratorio de cultivo celular



Flujo Laminar o campana de seguridad biológica:

mantienen la esterilidad del área de trabajo.

El laboratorio de cultivo celular



Espacios fríos:

Heladeras (4 °C) Freezer (-20, -40,-80 °C) Tanque de Nitrógeno Liquido (- 196°C)

El laboratorio de cultivo celular

Factores críticos



No biológicos

: orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc.



Biológicos: CONTAMINACIONES

La contaminación puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos tiene efectos adversos

Contaminaciones Biológicas

 Microorganismos: Bacterias Hongos/Levaduras Mycoplasmas  Otras células

Contaminaciones Biológicas

 Efectos adversos sobre el metabolismo celular     Pobre calidad de resultados experimentales Pérdida de células valiosas Pérdida de productos celulares (por ejemplo producción de antígenos para vacunas, etc.) Pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo

MUCHAS GRACIAS!!!

Aplicaciones en Oncología

Téc. Silvina Romero

Instituto de Oncología “Angel H. Roffo”

Aplicaciones de los cultivos celulares en la Investigación en cáncer

Investigación en Oncología

 Se realizan ensayos tendientes a:  Caracterizar el comportamiento de las células tumorales

in vitro e in vivo.

 Revertir la agresividad tumoral mediante drogas y herramientas genéticas tanto

in vitro

como

in vivo

.

Introducción

  

El cáncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células, con crecimiento y normales, metástasis.

división más allá de los límites invasión del tejido circundante y, a veces, La metástasis es la propagación a distancia de las celulas tumorales, por vía linfática o sanguínea, lo que implica el crecimiento de nuevos tumores en un lugar diferente al tumor original (primario).

Estas propiedades producen metástasis.

diferencian a los tumores malignos de los benignos, que son limitados y no

Celulas normales vs tumorales Células normales Células tumorales

Características de las células tumorales



Cambios en el citoesqueleto:

afectan: estos cambios

1.

2.

Forma (pleomorfismo)

: cambio de en la morfología y tamaño del citoplasma.

Adhesión/ Movilidad:

la reducción de la adhesión entre células y con la matriz celular facilita la favoreciendo metástasis movilidad la celular aparición de

Características de las células tumorales



Cambios nucleares:

diagnóstico  tiene valor Número: celulas multinucleadas   Forma: mas grandes o mas pequeños Organización de los núcleos: (nucleolos prominentes)  Hipercromasia: por la presencia de mayor cantidad de ADN.

Características de las células tumorales



Producción de enzimas proteolíticas:

permiten invadir los tejidos adyacentes facilitando la migración y la propagación de las células tumorales.

Características de las células tumorales



Grado de diferenciación celular:

dio origen.

las células neoplásicas por su alta tasa de proliferación se desdiferencian pareciéndose al tipo celular que le 

Alteraciones en el crecimiento:

crecen de manera desordenada, pierden la polaridad celular y no respetan límites por contacto célula-célula.



Resistencia a la apoptosis:

muerte celular programada

Biología Molecular del Cáncer

 La transformación maligna implica la adquisición progresiva de una serie de

cambios genéticos y bioquímicos

específicos que actúan desobedeciendo los fuertes mecanismos antitumorales presentes en las células normales.

Investigación en Oncología

 Se trabaja con dos modelos 

Celulares:

vitro

) Líneas celulares cancerígenas (

in



Animales de

vivo

experimentación:

) a los cuales por Ratones (

in

inyección de la celulas tumorales se les genera la enfermedad experimentalmente.

Estudios in vitro

Investigación en Oncología



Lineas celulares tumorales usadas en nuestro laboratorio

.

– LM3 : Ca mamario murino – MCF7: Ca mamario humano – MB49: Ca de vejiga murino – – – T24: Ca de vejiga humano LP07: Ca de pulmón murino Entre otras…

Estudios celulares

Estudios celulares:



Morfológicos



Funcionales



Mixtos



Cromosómicos

Estudios Morfológicos:

 Observación en fresco o post fijación (formol neutro) de monocapas celulares, en microscopio óptico invertido, contraste de fase, fluorescencia etc.

Estudios funcionales:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Viabilidad celular Adhesión * Ensayos clonogénicos* Migración* Actividad enzimática* Citotoxicidad

* evalúan la capacidad invasiva y metastásica.

Estudios funcionales: 1- Viabilidad celular:

   

Se siembra en placas multipozo una cantidad conocida de células Se las somete a “hambreado” colocando medio de cultivo sin suero (SFB) durante 72hs Se evalúa la actividad celular (viabilidad) por fotocolorimetría.

La producción del color se debe a la metabolización del reactivo (MTS) llevado a cabo por las células vivas.

Estudios funcionales: 1- Viabilidad celular:

Estudios funcionales: 2 Ensayo clonogénico en agar:

 Capacidad de crecer en un medio independiente de anclaje .

 Formación de colonias celulares a partir de una única celula.

Estudios funcionales: 2 Ensayo clonogénico:

Estudios funcionales: 3 Migración: Ensayo de cicatrización de heridas

 las Se realiza una herida en la monocapa y se deja a células crecer durante un tiempo determinado en presencia específicas.

de tratamientos o condiciones  La migración se evaluará a través del porcentaje de cubrimiento del área inicial.

Estudios funcionales: 3 Migración: Ensayo de cicatrización de heridas

Tipo celular 1 Tipo celular 2 Tipo celular 3

Estudios funcionales: 4- Citotoxicidad celular :

 Se utiliza para encontrar la dosis justa de drogas o reactivos que generen el efecto deseado sin dañar la monocapa.

 Se puede buscar la muerte de la totalidad de las células (ej. Drogas quimioterápicas).

Estudios funcionales: 5- Citotoxicidad celular :



Igual cantidad de celulas en cada posillo.



Dosis creciente de reactivo o droga



El resultado se evalua con una curva dosis respuesta

.

Estudios mixtos

 Mofológicos y funcionales: 

Inmunofluorescencia:

empleo de Ac.fluorescentes

Estudios cromosómicos



Cariotipo:

estudia la de los cromosomas morfología y número Nos da una idea de la los cultivos celulares.

evolución de

Estudios cromosómicos Translocaciones Regiones homogéneamente teñidas

Estudios Moleculares

Estudios Moleculares

 Se utiliza: 

Lisados celulares

nucleicos, etc) : el producto de la destrucción celular y purificación de la fracción a utilizar (proteínas, ácidos 

Partes celulares

: obtención de núcleos, citoplasmas, membrana celulares etc.



Medios condicionados:

se utilizan los medios en los que crecieron las células y se estudian factores de crecimiento, proteínas, etc. secretadas al exterior.

Electroforesis en gel Fundamento:

 Migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico  estas partículas migran hacia el polo – o positivo+ según la combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.

Utilidades:

 Separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas.

 Aportan un potente criterio de pureza

Electroforesis en gel:

 Gel de Poliacrilamida: para separar proteínas.

 Gel de Agarosa: para separar Ácidos Nucleicos.

Separación de moléculas Electroforesis en gel

Estudios Moleculares



Biomoléculas

mas importantes en investigación: 

ADN



ARN



PROTEINAS

Estudios del ADN



Electroforesis en gel

 El ADN extraído por lisis celular, se corta con enzimas para obtener diferentes fragmentos.

 Se realiza la corrida electroforética en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN e identificarlos según su peso (kb)  Luego de la electroferesis, se tiñe el gel con colorantes que emiten fluorescencia al ser excitado con luz UV:

Estudios del ADN



Colorantes fluoerescentes



BROMURO DE ETIDIO:

altamente tóxico y mutagénico.

Estudios del ADN



Colorantes fluoerescentes



SYBR green, SYBR safe, SYBR gold.



No es mutagénico ni tóxico.

Estudios del ADN



PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa Usos:



Detección de mutaciones

 

Amplificación de genes de interés Estudios diagnósticos

Estudios del ADN Transfección : Introducción de un fragmento de ADN externo a una célula animal.

Para qué?



Caracterizar oncogenes

   

Confirmar la identidad de genes Síntesis de ARN Expresión de proteínas, etc Estudio de síntesis y transporte intracelular

Cómo se introduce el ADN a la célula?

   1.

Una de técnicas es usando virus.

El proceso se llama INFECCIÓN Una vez que el virus infecta las células en cultivo:

El fragmento de ADN de interés pasa del citoplasma al núcleo celular.

2.

3.

  Se expresa produciendo el efecto deseado.

El ADN puede incorporarse en las células transfectadas de dos formas:

Momentánea

: transfección transiente. Llevada a cabo por Adenovirus

Estable

: implica la

integración del ADN genoma celular

. Retrovirus.

Selección de las células transfectadas Junto con el ADN a insertar se incorporan genes que nos permiten identificar en cultivo a las células transfectadas.

Genes mas utilizados:

 Resistencia a antibióticos:  Hygromicina  G418 Las células que no incorporaron el ADN durante la transfección mueren al colocar estos atb.

 Permiten la expresión de GFP (proteína verde fluorescente)

Proteína verde fluorescente GFP Cultivos celulares Animales de laboratorio La proteína GFP fluorece bajo luz UV, la presencia esta proteína en la célula nos da la idea de una transfección exitosa: si está la proteína en la celula también esta nuestro ADN de interés .

Estudios de ARN



Electroforesis en gel:

Gel tenido con BrEt y mirado con UV

Estudios de ARN

 Recientemente:

Transfección con ARN ARN interferente

Suprime la expresión de un gen en particular.

Es un ARN complementario al ADNm y al unirse a éste promueve su degradación.

Estudios de Proteínas

 Se usan lisados celulares  Sirve para identificar, cuantificar y evaluar la función de proteínas como:   Enzimas Proteínas estructurales  Receptores  Sirve para evaluar indirectamente la funciones de genes a través de su producto: Las Proteínas!

Estudios de Proteínas: Western Blot

Western Blot

Western Blot

 Para la proteína utiliza peso identificación de la un de interés “marcador de molecular”, se que indica PM correspondiente a cada altura del gel.

Western Blot

Estudios In vivo

Investigación en Oncología

 Animales de experimentación: contamos con un bioterio con cria propia de ratones.

 BALB/C  C57 B16/ J-GFP

Estudios in vivo

 

Objetivo:

Estudiar el comportamiento celulares que generados

in vivo in vitro.

de los modelos  

Metodología:

Inyección subcutánea, endovenosa, intraperitoneal, etc., de las células en estudio.

 Colocación de parches de las drogas en estudio en ratones a los cuales se les provocó experimentalmente la enferemdad.

Estudios in vivo

   

Se evalúa:

Capacidad tumorigénica: porcentaje de toma tumoral.

Capacidad metastásica espontánea: producción de metástasis por inoculación de celulas tumorales

in situ

.

Capacidad metastásica experimental: producción de metástasis por inoculación ev de las células en estudio.

Estudios in vivo Capacidad tumorigénica

Estudio in vivo

 Metástasis experimentales: via e.v. 21 días post inyección se cuentan las mts pulmonares

Aplicaciones en otros campos

Otras aplicaciones:

 Virología:      Aislamiento y multiplicación de virus Producción de vacunas Estudio y producción de antivirales Detección de virus desconocidos Estudios de oncogénesis viral

Otras aplicaciones:

 Transplantes/Injertos:   Cultivo de piel Cultivo de celulas stem (pluripotentes)  Cultivo de hepatocitos, etc islotes pancreaticos,

Otras aplicaciones:

    Fertilización

in vitro

Producción de biológicos (proteinas, anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas).

Producción de transgénicos: GMOs (organismos geneticamente modificados: soja, arroz, ovinos, caprinos, etc.) Transgenesis parcial: Terapia génica en humanos.

Agradecimientos:

 Área de Investigación Instituto Roffo: - Dra Lydia Puricelli - Dr Martin Krasnapolski - Lic. Maria Ines Diaz Bessone - Lic. Denis Belgoroski

MUCHAS GRACIAS!!!